天臺鐵線蓮花色變異的轉錄組分析

葉友菊， 胡青荻， 鄭堅， 馬曉華， 張旭樂， 錢仁卷

(浙江省亞熱帶作物研究所 溫州市資源植物創新利用重點實驗室，浙江 溫州 325005)

毛茛科鐵線蓮屬(Clematis)植物，因花朵艷麗被譽為園林中的“藤本皇后”[1-2]，廣泛應用于盆栽花卉等[3]。我國鐵線蓮屬植物種類繁多，其中天臺鐵線蓮為浙江特有瀕危種，是浙江省重點保護野生植物[4]。天臺鐵線蓮為平展型大花，花期一般在5—6月，花萼通常為白色[5]，花量大、花色變異豐富，極具觀賞價值，且兼備藥用價值，是不可多得的鐵線蓮育種親本[6]。

花色素的存在及其變化是植物花色表現的化學機制，絕大多數植物累積特定的花色素種類，從而呈現出一定的花色表型，與花色的深淺程度密切相關[7]。近年來，隨著測序技術的高速發展，植物育種研究也有了新的思路和手段，基于組學分析植物花色素苷的合成與調控已成為植物花色素苷新的研究方向[8-9]。鄧嬌等[10]基于轉錄組測序揭示雙色花蓮大灑錦花色形成機理；潘新怡[11]基于組學對紫花苜?；ㄉ嚓P基因進行了挖掘與鑒定；趙君等[12]通過代謝組學對向日葵不同花色物質組成進行分析。不難發現，組學已經成為目前植物花色研究的熱門方向。

本課題組在天臺鐵線蓮引種馴化過程中發現了花萼呈現白色和紫色相間以及花萼全部為藍紫色的多個變異植株，且在連續3個開花周期的觀察下都呈現穩定的花色性狀，該發現不僅為鐵線蓮增加了重要的花色種質資源，也為研究鐵線蓮花色變異形成機制提供了理想的材料。為了進一步探究影響花色素形成的機制，我們利用天臺鐵線蓮的白色原種和花色變異材料進行了轉錄組測序，通過GO和KEGG富集及功能注釋，挖掘可能參與花色變異的差異表達基因，為闡明天臺鐵線蓮的花色變異機制提供基礎資料，同時對于了解其余種類鐵線蓮花色的形成以及培育也具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用試驗材料為浙江省溫州市的浙江省亞熱帶作物研究所國家鐵線蓮種質資源庫保存的天臺鐵線蓮，選取花色為白色(TTCB)的原種、花萼呈現淡紫色相間(TTJD)、紫色相間(TTJ)、藍紫色相間(TTJZ)以及花萼全部為藍紫色(TTSZ)的變異植株為試驗材料(圖1)。所選植株為同一生長環境下同一物種的不同變異，無病蟲害。采樣時設3個生物學重復，新鮮采集的花朵立即用液氮速凍處理，然后儲存在-80 ℃用作RNA提取。

圖1 不同花色的天臺鐵線蓮材料

1.2 方法

1.2.1 文庫構建與轉錄組測序

天臺鐵線蓮花萼研磨在液氮條件下完成，選用植物RNA提取試劑盒(Tiangen，Beijing)進行RNA提取。RNA濃度和純度(D260/D280≈2.1，D260/D230>1.8)的檢測通過NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo，USA)完成，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析RNA的完整性。樣品檢測合格后，利用RNA文庫試劑盒進行mRNA純化及文庫構建(NEB，USA)，樣品的測序由美吉生物科技有限公司Illumina HiseqTM4000完成。

1.2.2 轉錄組數據處理及分析

Raw reads進行過濾處理后得到Clean reads。由于天臺鐵線蓮沒有相應的參考基因組序列，本研究采用de novo組裝方法，使用Trinity軟件對Clean reads進行組裝，之后利用Tgicl對轉錄本聚類去冗余，得到unigene作為后續分析的參考序列。采用fold change≥2.00、adjustedP≤0.05的方式篩選差異基因，差異基因的表達豐度用FPKM值表示。采用Blast2GO軟件對篩選到的DEGs進行GO富集分析并進行GO功能統計[13]?；贙EGG注釋結果，利用KOBAS 3.0對檢測到的差異基因進行pathway富集分析[14]。

2 結果與分析

2.1 RNA-Seq測序數據統計分析

天臺鐵線蓮白花和深紫花各設3個生物學重復，共構建15個cDNA文庫，基于Illumina HiseqTM4000測序獲得的數據詳見表1。經過濾篩選后共獲得了136.03 Gb的clean data，每個樣品獲得6 Gb左右的clean data，其中Q30的占比超過92%，GC含量均在45%以上(表1)。

表1 轉錄組測序數據

2.2 樣品主成分分析

為了進一步了解多個花色變異品種的關系，我們對樣品進行了主成分分析。結果表明，淡紫色相間(TTJD)以及紫色相間(TTJ)的花與原種白色(TTCB)的花差異較小，而在花色呈現藍紫色之后，與白色(TTCB)的花差異則明顯增大(圖2)。這一現象也與天臺鐵線蓮花色性狀一致。

圖2 樣品主成分分析

2.3 差異表達基因分析

為進一步探究天臺鐵線蓮花色變異機制，我們構建了韋恩圖，結果表明，17 550個基因在所有花色中都表達(圖3)。對差異表達的基因進行統計，發現白色花(TTCB)和藍紫色花(TTSZ)之間存在最多的差異基因，數量高達24 016個，其中11 543個基因發生上調，12 473個基因發生下調，其次是淡紫色相間的花(TTJD)和藍紫色花(TTSZ)、紫色相間的花(TTJ)和藍紫色花(TTSZ)以及藍紫色相間的花(TTSZ)和藍紫色花(TTSZ)之間的差異基因。

2.4 差異表達基因GO分類

差異表達基因GO分類統計分析結果表明，天臺鐵線蓮花色變異的DEGs主要富集在生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)(圖4)，這些結果對于花色的形成和變異具有重要的指導意義。在TTCB 與 TTJ的富集結果中，DEGs主要富集在生物合成和代謝過程方面，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJZ和TTCB與TTSZ的富集結果中，DEGs主要富集在代謝過程方面。在TTCB 與 TTSZ的富集結果中，BP中的不飽和脂肪酸代謝過程(GO:0033559和GO:0006636)、一元羧酸代謝過程(GO:0072330)顯著富集，MF中的萜烯合成途徑(GO:0016835)和檸檬烯合成途徑(GO:0010333)顯著富集，說明這些都參與到花色變異的機制中。

圖3 不同花色的差異表達基因分析

圖4 差異表達基因的GO富集

2.5 差異表達基因KEGG富集分析

進一步通過KEGG富集分析表明，在TTCB與TTJ的富集結果中，DEGs主要富集在生物合成和代謝過程方面，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJZ和TTCB與TTSZ的富集結果中，DEGs主要富集在代謝過程方面。不難發現大多數DEGs顯著富集在萜類生物合成、氮代謝、吲哚生物堿生物合成、生物素代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等代謝途徑(圖5)。此外，對天臺鐵線蓮花色影響最為重要的花青素合成途徑，在TTCB與TTSZ中達到最多的差異基因數量(17個)，而在TTCB與TTJD、TTCB與TTJ和TTJ與TTSZ中分別是6、10和16個，表明隨著花色差異增大參與花青素合成的差異基因越多。

圖5 差異表達基因的KEGG富集

3 討論

花色是觀賞植物重要的性狀指標，鐵線蓮作為我國重要的觀賞類植物，如何培育花色豐富的鐵線蓮新品種是鐵線蓮育種者一直以來追求的目標，因而了解鐵線蓮花色形成及變異的分子機理顯得尤為重要[15-17]。影響植物花色的因素有很多，包括光照、水分和溫度等外部環境因素，但是最主要的還是由基因決定其呈色[18-19]。從分子層面對不同性狀之間基因差異進行分析成為主要研究方向之一[20-21]。隨著近年來高通量測序技術高速發展，轉錄組測序在植物分子研究中得到廣泛的應用。

本研究以天臺鐵線蓮的白花為對照組，多個花色變異品種為試驗組，進行轉錄組測序，并獲得136.03 Gb的clean data。差異基因統計分析表明，天臺鐵線蓮的白色花和藍紫色花存在最多的差異基因，高達24 016個，且這些差異基因主要富集到代謝過程中。進一步對差異表達基因KEGG通路富集結果進行分析，發現TTCB與TTSZ在花青素合成途徑中富集到最多的差異基因(17個)，TTCB與TTJZ存在16個差異基因，而TTCB與TTJD和TTCB與TTJ中分別僅有6和10個。結合PCA分析，可以發現隨著藍紫色物質的積累，與白色花的差異越來越大，而這些差異基因可能也是造成天臺鐵線蓮花色存在差異的重要原因(圖2)。徐建等[22]通過對矮牽牛基因組進行生物信息學分析及F3′5′H基因的功能鑒定，發現F3′5′H基因促使轉基因后代的矮牽?；ò瓿尸F紫色；洪燕紅等[23]發現，在紅花草莓中FaMYB82、FaMYB6、FaMYB90可能通過調節FaPAL、Fa4CL、FaDFR和Fa3GT的表達來調控花瓣色澤的形成。在本研究中，通過轉錄組測序結果可以發現白色和藍紫色花之間存在著較多的差異基因，其花青素合成途徑中也存在著較大的差異，但具體機制還需要進一步的研究[24]。