血清長鏈非編碼RNA Rpph1表達對2型糖尿病患者蛋白尿進展的預測價值研究

吳翔，毛盛程，陳浪

（浙江省立同德醫院 內分泌科，浙江 杭州310012）

2 型糖尿病近年在我國的發病率逐步升高，隨病情加重產生各種急慢性并發癥，嚴重影響患者的生活質量，甚至威脅生命。糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）是最為常見的糖尿病微小血管并發癥，是終末期腎病的主要病因之一。該病存在復雜的代謝紊亂，且一旦進展至終末期腎病，其治療比其他腎臟疾病更棘手[1-3]。早期預防DN 的發生及延緩其進展具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）缺乏編碼蛋白質的能力，被發現影響多種疾病的發生、發展。其中，lncRNA Rpph1 被發現可影響高糖培養的腎小球系膜細胞炎癥因子表達[4]，推測其參與慢性腎病的炎癥過程。目前關于lncRNA Rpph1 與DN 內在聯系的研究較少，本研究以此為切入點探討lncRNA Rpph1 對DN 病情進展的影響，旨在進一步研究DN的發病機制，為后續治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性研究。選取2016年1月—2018年1月浙江省立同德醫院內分泌科因控制血糖重復住院治療的2 型糖尿病患者268 例為研究對象。納入標準：①明確的2 型糖尿病史；②首次及第2 次住院治療的時間間隔2～4年；③首次住院時留取血清樣本；④首次住院時臨床資料完整。排除標準：①合并1 型糖尿病或其他類型糖尿病；②合并糖尿病酮癥酸中毒或其他嚴重糖尿病合并癥；③合并甲狀腺功能異常、垂體瘤、嗜鉻細胞瘤等其他內分泌疾病；④合并急慢性基礎腎臟疾病；⑤合并惡性腫瘤；⑥入院前2 個月內有激素、利尿劑應用史。

1.2 方法

1.2.1 收集所有患者首次入院的臨床資料 性別、年齡、體質量指數（BMI）、糖尿病家族史、糖尿病病程、吸煙、飲酒、合并癥、用藥情況、空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、 血肌酐（Scr）、 尿素氮（BUN）、血尿酸。

1.2.2 24 h 尿蛋白檢測及分組 微量蛋白尿是診斷DN 的標志，指尿蛋白定量為30～300 mg/24 h。本研究通過24 h 尿蛋白檢測，定義24 h 尿蛋白定量＜30 mg 為無蛋白尿，24 h 尿蛋白定量≥30 mg 但＜300 mg 為微量蛋白尿，24 h 尿蛋白定量≥300 mg 為大量蛋白尿。檢測所有患者首次、再次入院的尿蛋白定量。同一患者再次入院后，由之前的無蛋白尿進展至微量蛋白尿，或者由微量蛋白尿進展至大量蛋白尿，或者大量蛋白尿患者Scr 水平翻倍為蛋白尿進展。以此為分組依據將患者分為蛋白尿進展組（n=62）和蛋白尿非進展組（n=206）。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量 留取初次入院患者的空腹外周靜脈血標本5 mL，4℃下靜置30 min，室溫下3 000 r/min 離心15 min，取上清液冷凍保存于-80℃冰箱。Trizol（購自上海百蕊生物科技有限公司）提取血清樣本中的總RNA，參照AMV 逆轉錄試劑盒（購自上海索寶生物科技有限公司）說明書將其逆轉錄為cDNA，以cDNA 為模板，采用2×SYBR Green PCR Master Mix 進行qRT-PCR，qRT-PCR 試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。以P53為內參。引物序列檢測及合成由生工生物工程（上海）有限公司完成。lncRNA Rpph1 引物：正向5'-TTCGAACGATGATCGATGA-3'，反向5'-CTGAAGCTAAGCTGAGTCG-3'；P53 引 物：正 向5'-AGCTTGTCAGAACGTAGCT-3'，反向5'-CTTGAA CGTTAGCGATAG-3'。反應體系：cDNA 2 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、正反向引物各0.6 μL、去離子水補足至20 μL。反應條件：95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量，實驗進行3 次，取平均值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制ROC 曲線；影響因素的分析采用多因素Logistic 回歸模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者首次入院的臨床資料比較

兩組患者首次入院的糖尿病病程、合并高血壓、使用二甲雙胍、Scr、血尿酸、lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組患者首次入院的性別、年齡、BMI、糖尿病家族史、吸煙、飲酒、合并冠心病、使用血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素受體拮抗劑（ARB）、使用胰島素、使用他汀類藥物、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C、BUN 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者首次入院的臨床資料的比較

2.2 蛋白尿進展的影響因素分析

以再次入院后蛋白尿進展為因變量（0=非蛋白尿進展，1=蛋白尿進展），將首次入院的臨床資料單因素分析中有統計學意義的指標（糖尿病病程、合并高血壓、使用二甲雙胍、Scr、血尿酸、lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量）為自變量，納入Logistic 回歸模型，結果：合并高血壓[=3.271（95% CI：1.864，3.872）]、使用二甲雙胍[=2.192（95% CI：1.253，2.413）]、Scr 水 平[=1.873（95% CI：1.211，2.063）]、血 酸水平[=2.321（95% CI：1.432，2.784）]、lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量[=2.621（95% CI：1.732，3.064）]是2 型糖尿病患者蛋白尿進展的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 白蛋白尿進展影響因素的多因素Logistic回歸分析參數

2.3 血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量對蛋白尿進展的預測價值

首次入院血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量預測蛋白尿進展的最佳截斷值為0.564，曲線下面積（AUC）為0.800（95% CI：0.742，0.858），敏感性為67.48%（95% CI：0.517，0.784），特異性為82.26%（95%CI：0.684，0.935）。見圖1。

圖1 血清lncRNA Rpph1 mRNA相對表達量預測蛋白尿進展的ROC曲線

3 討論

DN 的病因及發病機制尚不明確，可能涉及遺傳、腎臟血流動力學異常、高血糖致代謝異常、血管活性物質代謝異常等多因素[5-7]，但部分初始病情相似患者的疾病進展速度存在較大差異，推測存在其他影響疾病進展的因素。DN 患者開始出現蛋白尿并隨病情進展尿蛋白定量逐步增加，是病情惡化的重要標志[8-10]。本研究使用Logistic 回歸模型分析蛋白尿進展的影響因素發現：合并高血壓、使用二甲雙胍、Scr 水平、血尿酸水平、lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量高均是2 型糖尿病患者蛋白尿進展的獨立危險因素。

高血壓是腎病發生的重要促發因素[11-12]；二甲雙胍可能增加腎功能不全者乳酸酸中毒的風險[13-14]；Scr 是最為重要的腎功能指標之一，2 型糖尿病患者早期Scr 水平較高提示其腎功能存在潛在損傷，腎臟組織對高血糖帶來的一系列代謝紊亂的耐受度較弱[15-17]；血尿酸也在不同研究中被證實是DN 進展的重要因素之一，可能與高尿酸血癥加速腎血管內皮功能紊亂、促進腎臟炎癥反應等機制相關[18-20]。

既往研發現lncRNA Rpph1 可誘導神經元損傷[21]；且可促進外泌體介導的巨噬細胞M2 極化，促進結直腸癌轉移[22]，但關于lncRNA Rpph1 與糖尿病及DN 的研究較少。本研究結果發現，血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量較高與DN 患者蛋白尿進展密切相關，這是繼張攀揚等[4]的研究后，再次明確了lncRNA Rpph1 高表達對DN 病情進展的意義。ZHANG 等[23]研究指出，在7 個與DN 相關的lncRNAs 中發現lncRNA Rpph1 表達顯著升高，且在高糖狀態下可通過Gal-3/Mek/Erk 信號通路促進系膜細胞的增殖和炎癥反應下調lncRNA Rpph1 表達，提示lncRNA Rpph1 通過Gal-3/Mek/Erk 信號通路影響DN 的腎臟炎癥反應。DN 的病情進展與炎癥密切相關，肖瑛等[24]也證實抑制炎癥反應可減輕DN 大鼠的腎組織纖維化。有研究[25]報道，lncRNA Rpph1激活腎臟炎癥反應的作用可能是其成為DN 病情近期進展的重要原因，但具體機制有待進一步研究。

lncRNA Rpph1 的表達變化在DN 蛋白尿進展中起重要作用，本研究進一步探討其對蛋白尿進展的預測價值。ROC 曲線分析發現：首次入院血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量預測蛋白尿進展的最佳截斷值為0.564，AUC 為0.800，敏感性為67.48%，特異性為82.26%。以上結果提示，早期血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量檢測對后續DN 患者蛋白尿進展具有預測價值，可能成為后續DN 患者病情進展風險篩查、針對性干預措施制訂的參考指標。

綜上所述，血清lncRNA Rpph1 mRNA 相對表達量是2 型糖尿病患者蛋白尿進展的獨立危險因素之一，其對蛋白尿進展具有預測價值。