人尿源性誘導多能干細胞在遺傳病治療中的應用前景＊

袁艷萍，鄭志娟，李運倫

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南250014）

人類遺傳病主要是在異源系統或動物模型中進行研究，其結論從未被直接檢驗過[1]。直至目前，隨著干細胞在再生醫學方面應用的推廣，逐漸實現對完全在體外發育的患者源性細胞進行基因測序及生理測試。誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）具有自我更新和多向分化能力，可以根據不同的重編程效率從不同的細胞類型中產生不同的細胞株[2]。人iPSCs 的細胞來源逐漸實現了非侵入性、簡單、成本低的突破[3]。利用尿源性iPSCs 衍生的與疾病表征相關的細胞模型可以為個性化醫學提供一種新的生物資源，這種新的資源被用于機制探索、測試新發現的化合物、基因編輯及治療等，促進了遺傳病精確化醫療的發展。

1 人尿源性誘導多能干細胞

1.1 人尿源性誘導多能干細胞的特征

干細胞在再生醫學、細胞替代治療及藥物篩選等領域有著廣泛的研究及應用前景。隨著2006年日本京都大學YAMANAKA 教授研究的iPSCs 的出現[4]，iPSCs 在疾病模型復制、再生醫學、藥物篩選等領域的應用不斷創新和擴展。iPSCs 重編程比較常見的細胞類型可能是皮膚成纖維細胞、臍帶血、外周血、角質細胞，但這仍然需要活檢，直接阻礙了研究需求中的自愿捐贈[5]。理想的方法應是通過非侵入性、簡單及低成本的程序[6]，從健康受試者或任何年齡、性別、人種的患者中普遍獲得最佳細胞來源。現代醫學研究中，人類泌尿系統由一個復雜的小管網組成，在正常的生理條件下，成千上萬的細胞從管狀系統、輸尿管、膀胱和尿道脫落，并散布在尿液中[7]。尿液細胞是一種身體垃圾，2012年有報道稱脫落的腎上皮性尿液細胞能有效地產生iPSCs，而且尿液細胞也具有易獲取、成本低、效率高且無倫理學問題等優勢[3]。并有研究證實與人皮膚成纖維細胞或成人脂肪來源間充質干細胞（MSCs）相比，尿源性iPSCs 具有更快的重編程動力學[8]，與胚胎干細胞或其他來源的iPSCs 相比，尿源性iPSCs 表現出相似的表達和多能模式[9]。

1.2 尿液細胞重編程為iPSCs

iPSCs 重編程的原理指利用體細胞核移植（SCNT）、細胞融合、OSKM 轉錄因子及小分子轉導等技術將維持干細胞特性的關鍵轉錄因子轉移至成熟的體細胞內，將人成熟的體細胞重編程為人iPSCs，通過轉錄因子基因的異位表達從而具有干細胞特性[10]。

目前常用的重編程方法有通過慢病毒或逆轉錄病毒轉導將重編程因子整合到基因組中[11]。這種方法可以實現高效的基因轉移和長期表達，但由于外源基因永久和隨機整合所產生的細胞有一定的致癌潛力，因此不適用于治療。為避免使用整合病毒，目前逐漸出現不同類型的非整合重編程方法，如質粒轉染[12]、游離載體[13]、仙臺病毒[14]、mRNA[15]等的介導，與此同時能夠模擬或替代重編程因子的小分子逐漸被發現[16]，如Valproic acid、CHIR99021、Vitamin C 等小分子。由于不同的細胞系的基因表達譜有差異，理想的重編程因子組合和誘導條件與細胞類型有很大的關聯[17]。通過對文獻的搜集整理，下面總結幾種針對尿液細胞高效、低風險的重編程方法。

1.2.1 質粒轉染和化合物干預相結合的方法 外源基因表達方法使用的基本方法是質粒載體，因為與線性DNA 相比，質粒載體不容易受到外核酶的影響。質粒轉染的重編程效率與病毒載體相比雖然效率偏低，但因其可控成本及安全性，非染色體質粒攜帶的重編程因子獲得非整合iPSCs 的方法逐漸被廣泛使用。在此基礎上，進一步發現使用小分子化合物不僅可以降低致瘤風險，而且可以提高其重編程效率。

CHENG 等[18]用含OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT、c-MYC及LIN28基因的pEP4-EO2S-ET2K 和pEP4-M2L 質粒電穿孔尿液細胞，進一步用含4 種小分子化合物的N2B27 培養基進行培養，結果在10 d 左右就成功培養出iPSCs，其重編程效率可達每孔80 個克隆。WANG 等[19]通過篩選多種重組質粒組合和多種化合物，最終確定低風險因子和小分子化合物，建立了一個高效的外泌體系統，即6F/BM1-4C 系統，該系統因缺乏人類尿源性細胞重編程的致瘤因子，從而可降低致瘤風險，證實6F/BM1-4C 系統在細胞遺傳學水平上較為穩定，具有潛在的臨床應用價值。LI 等[20]進一步研究如何提高尿液細胞的重編程效率，在質粒電轉染的基礎上，加入6 種小分子化合物，同時發現用自體喂養替代基質膠可以克服重編程過程中出現的大量細胞死亡所導致的重編程失敗，此方法進一步提高尿液細胞的重編程效率，為成功培養iPSCs 提供便利。

1.2.2 仙臺病毒載體轉染 由于轉基因隨機地整合到宿主基因組中，并導致轉基因重新激活或突變，因此存在一定的風險性。仙臺病毒的重要特征在于其能夠在細胞質中完全復制，且無法進入受感染細胞的細胞核[21]，因此消除了通過表觀遺傳修飾改變宿主基因組和基因沉默的風險[22]。仙臺病毒能夠以非整合形式感染多種細胞類型，且在轉導后24 h 內具有高的轉導效率和快速的表達能力[23-24]，因此常被用于細胞的有效重編程。

表1 利用質粒電穿孔轉染結合化合物干預將尿液細胞重編程為iPSCs

AFZAL 等[25]在將肌營養不良患者尿液細胞重編程為iPSCs 的過程中，提出一種非整合仙臺病毒載體的重編程方式，將OSKM 轉錄因子導入患者的尿液細胞中。該方案在2～3 周內生成完全重編程的克隆。后來，隨著技術的進步，研制出了iPSCs 仙臺重編程試劑盒，LIN等[26]用該試劑盒也成功地將尿液細胞誘導成iPSCs。SAUER 等[27]在將人尿上皮細胞重編程為iPSCs 并分化為肝細胞的研究中，分別采用了仙臺病毒轉染和質粒轉染兩種方法，前者是用表達重組因子hOCT3/4、hSSOX2、hKLF4及hcMYC的重組仙臺病毒感染第2 代尿路上皮細胞，后者是用1 組3 個oriP/ebna Epposal 質粒轉染尿路上皮細胞，通過核轉染其表達重組因子OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LINL28及抗p53的shRNA，兩種方法都可提供令人滿意的重編程效率。然而，當比較來自同一供體的尿細胞時，基于仙臺病毒的方法獲得的菌落和重編程效率均高于基于質粒轉染的方法。由此推斷來自同一供體的尿液細胞，基于仙臺病毒的重編程方法更有效。

1.2.3 mRNA 重編程 在克服iPSCs 重編程風險和低效率的障礙中，mRNA 重編程技術因其矢量清晰的暫態特性，對重編程因子給藥、化學計量和時間的靈活控制，以及其衍生iPSCs 生成的速度和效率的優越性，可能成為產生多能干細胞的最有希望的方法之一[15]。

GAIGNERIE 等[28]在尋求將mRNA 重編程應用于最易獲得、可選擇的細胞類型的研究中，采用含38% OCT4，11.4% SOX2，12.7% KLF4，10.1% LIN28，12.7% MYC，10.1% Nanog，5.1% nGFP 的mRNA 重編程方案對成纖維細胞、牙髓細胞、尿液細胞進行重編程，11 d 后觀察以上3 種細胞分別出現21 個、140 個、4 個hiPSCs 克隆，但尿液細胞來源iPSCs 是最早出現。尿液細胞是一個異質的群體，從多個尿源性細胞系中分離得到iPSCs 克隆證實沒有出現基因組異常，表明這種重編程的穩定性。后期通過重復和優化證實了mRNA 重編程可以用于包括尿液細胞在內的多種易獲得的細胞類型，并且在4 個不同的患者細胞系上是可重復的。

2 人尿源性iPSCs 在遺傳病細胞模型中的應用

遺傳病患者自身來源的iPSCs 可以提供包含遺傳背景在內的特定細胞模型，發揮通過比較遺傳背景中的表型來檢測病理表型中的突變的特異性作用，拓展個性化藥物篩選，同時也逐漸實現了基因的原位轉化，促進了精確化治療的發展。

2.1 在心臟相關遺傳病中的應用

之前由于人心肌細胞的來源極其有限，人類遺傳性心臟疾病主要在獨立于患者的“遺傳背景”的異源系統或動物模型中進行了研究。自從尿源性iPSCs 的出現，人們一直致力于利用iPSCs 細胞進行心臟相關遺傳病的疾病機制研究和心臟修復，目前逐漸探索尿源性iPSCs 衍生的心肌細胞攜帶的遺傳物質及基因突變特征與患者病理特征的關系，以及利用誘導而來的心肌細胞的自發收縮功能進行藥物的高通量篩選。

JOUNI 等[29]將尿源性誘導多能干細胞分化為心肌細胞（UhiPS-CMs），用UhiPS-CMs 來模擬和表征2 型長QT 綜合征的分子表型，結果發現A561P KCNH2 突變導致人CMS 中HERG 通道的轉運缺陷，從而增加了心律失常的易感性。CAO 等[30]成功地用仙臺病毒載體從一位患有心力衰竭的室間隔缺損（VSD）患者的尿液樣本中獲得了非整合型UiPSCs，該患者的RyR2基因存在L2483R 突變。進一步通過小分子調控Wnt 信號將UiPSCs 快速有效地分化為功能性心肌細胞，經基因檢測證明該來源的心肌細胞攜帶遺傳基因突變并具有與患者病理有關的特征，從而加快iPSCs 向高通量篩選應用或再生治療的轉化。MLEE 等[31]在唐氏綜合征的研究中，通過電穿孔獲得的尿源性T21-iPSCs，經熒光原位雜交驗證和光譜核型分析后，證明T21-iPSCs可以維持其細胞遺傳的完整性，促進了對T21 表型系統特征相關的研究。在此基礎上，進一步利用胰島素剝奪法[32]成功地將T21-iPSCs 分化為心肌細胞，這些分化的心肌細胞在功能上表現為自發收縮，對β 腎上腺素能激動劑異丙腎上腺素敏感，為高通量篩選改善唐氏綜合征患者生活質量的潛在藥物奠定了基礎。

2.2 在肌營養不良相關遺傳病中的應用

肌強直性營養不良（myotonic dystrophy, DM）是一種常染色體顯性核苷酸重復擴張障礙，伴有骨骼肌強直、無力，以及心律失常、心力衰竭[33]。根據遺傳病疾病特征，利用iPSCs 衍生出的具有相關疾病表型的心肌細胞，通過觀察RNA 表達情況、心肌細胞的肌纖維收縮張力、Ca2+瞬時表達來揭示遺傳病的基因調控差異和不同類型的病理特征差異。

KIM 等[34]在肌強直性營養不良機制的研究中，利用質粒電穿孔的方法從健康對照組、DM1 和DM2受試者中誘導出多能干細胞（iPSCs），并將其分化為心肌細胞。利用高分辨率成像證明來自DM1 而不是DM2 的iPSCs 來源的心肌細胞存在已知靶基因和MBNL 的異常剪接，同時DM1和DM2 iPSCs 衍生心肌細胞的Ca2+瞬時表達不同，RNA 序列顯示兩者的基因表達有明顯的失調，也存在差異的異常剪接模式。以上研究結果表明DM1 和DM2 盡管有一些共同的臨床和分子特征，但有不同的病理特征。PIONER 等[35]在探索肌營養不良蛋白在心肌細胞發育和Duchenne型肌營養不良心肌病早期發展中的作用的研究中，分別從正常健康人和Duchenne 型肌營養不良患者尿液中獲得誘導多能干細胞分化的人心肌細胞（hiPSCCMs），將通過CRISPR 技術從健康人中獲得的肌營養不良蛋白缺乏的模型與從患者誘導的hiPSCCMs 做對比，結果發現缺乏Dp427 會導致肌纖維收縮張力降低、松弛動力學較慢以及Ca2+處理異常，這與Duchenne 型肌營養不良細胞相似，表明缺乏Dp427 與心肌細胞結構成熟延遲或改變有關聯性，該研究為探索Dp427 缺陷對心肌細胞發育早期的功能影響提供了新的見解。GUAN 等[8]通過對Duchenne 型肌營養不良癥患者的尿液細胞重編程，進一步誘導分化成心肌細胞，結果證明Duchenne型肌營養不良患者來源的心肌細胞保留了該類患者的肌營養不良蛋白突變，從而促進對該遺傳病的機制研究和藥物開發。

2.3 在其他遺傳病中的應用

隨著尿源性iPSCs 技術的成熟，其定向誘導的細胞種類逐漸增多，在遺傳病中的應用范圍越來越廣，不僅為以個性化方式研究遺傳病機制提供了一種有效的工具，同時促進了精確治療的發展。

2.3.1 脊髓型肌萎縮 脊髓性肌萎縮是一種以脊髓進行性運動神經元丟失為特征的神經肌肉疾病，是由存活運動神經元1（SMN1）基因的突變引起的，幾乎所有脊髓性肌萎縮患者存在一個類似SMN1 的基因，即存活運動神經元2（SMN2）[36-37]。ZHOU等[38]在脊髓肌萎縮癥的研究中，利用iPSCs 重組載體從脊髓性肌萎縮患者的尿液細胞中生成無c-Myc的、非整合的iPSCs,利用CRISPR/Cpf 1 和單鏈寡核苷酸（ssODN），在SMA-iPSCs 中實現了SMN2基因向SMN1基因的原位轉化，效率為4/36?；蜣D化的iPSCs 株系不含外源序列，并保留正常的核型。值得注意的是，在基因轉換的iPSCs 及其衍生運動神經元（iMNs）中有SMN 和基因定位的表達，這是人類細胞中Cpf 1 同源定向修復（HDR）介導的基因轉換的首次報道，為大多數脊髓性肌萎縮患者提供了一種通用的基因治療方法。

2.3.2 遺傳性肝病 肝細胞極性對于膽管的發育和肝內膽汁及廢物的安全運輸至關重要，在與肝細胞極性相關的遺傳性肝病研究中，OVEREEM 等[39]利用慢病毒載體的方法將1 例ATP7B 純合子突變和一例雜合子突變患者的尿液細胞重編程為iPSCs，并將其分化為肝細胞樣細胞（hiHpes），利用HiHeps 重述極化蛋白的轉運過程，以Cu2+誘導的銅轉運蛋白ATP 7B 再分布到膽管結構域為例，結果證明最常見但又令人費解的Wilson 病導致的ATP 7B-h1069q 突變本身并不能阻止將ATP7B 轉運到跨高爾基網，相反，其阻止了Cu2+誘導的極化再分布到膽管區，不能被藥物折疊伴隨分子逆轉，該研究表明功能細胞極性可在患者多能干細胞來源的hiHeps 中實現，首次實現了對內源性突變蛋白、患者特異性發病機制和藥物反應的研究。

2.3.3 血友病 血友病A 是由于缺乏凝血因子VIII（FVIII）而引起的單基因疾病，這種缺乏癥可能導致自發性關節出血或危及生命的出血，但無法治愈[40]。PANG 等[41]從重度血友病A 患者中獲得尿源性誘導多能干細胞（iPSCs），并利用轉錄激活劑樣效應因子鎳酶將第Ⅷ因子基因（F8）定位于HAiPSCs 中的多倍核糖體DNA（rDNA）位點，旨在解決FVIII 蛋白短缺的問題，結果表明外源F8 的多個拷貝可整合到rDNA 位點上，同時檢測到外源性F8 mRNA 和FVⅢ蛋白在靶向HA-iPSCs 中的表達，而且該來源的iPSCs 分化為內皮細胞（ECs）后，仍可檢測到外源性FVⅢ蛋白。結果表明，多拷貝rDNA位點可作為iPSCs 基因治療的有效靶點，這種策略為血友病A 和其他單基因疾病提供了一種新的基于iPSCs 的治療方案。

3 總結與展望

尿液細胞與其他iPSCs 重編程來源相比具有非侵入性、取材簡單、成本低、重編程效率高等優勢，iPSCs 重編程技術由最初的存在致瘤風險的慢病毒、逆轉錄轉導技術，逐漸優化為質粒、仙臺病毒、mRNA 等介導的非整合技術，同時促進重編程效率、降低風險的小分子化合物也逐漸被發現。隨著iPSCs重編程技術的成熟，其被定向分化的細胞種類逐漸在擴展。尿源性iPSCs 及其誘導分化而來的特定細胞因具備患者本身的遺傳特征，為遺傳病的機制探索、藥物篩選、基因治療提供了很好的研究模型。

目前，尿源性iPSCs 在遺傳病方面的應用范圍逐漸擴大。遺傳性心臟病、室間隔缺損等心臟相關性遺傳病的研究，證實了尿源性iPSCs 衍生的心肌細胞攜帶的遺傳物質及基因突變特征與患者病理特征的一致性，并且其表現出自發收縮的心肌功能為藥物的高通量篩選提供了可能。在肌強直性營養不良相關遺傳病方面，由尿源性iPSCs 衍生的心肌細胞進一步實現了通過觀察RNA 表達情況、心肌細胞的肌纖維收縮張力、Ca2+瞬時表達差異來揭示遺傳病的基因調控差異和不同類型間的病理特征。另外，在脊髓性肌萎縮、遺傳性肝病、血友病等相關遺傳病中，由尿源性iPSCs 衍生的細胞模型也逐漸實現了基因的原位轉化，促進了精確化治療的發展。

尿源性iPSCs 在遺傳病的研究上有很大的優勢，其衍生而來的心肌細胞、肝細胞樣細胞或其他細胞為遺傳病機制研究、藥物篩選、細胞治療提供了很好的模型。當然，未來還需在某些地方進一步提高，例如尿源性iPSCs 的重編程效率仍需進一步提高。同時，經iPSCs 誘導分化而來的細胞與自身原系統細胞相比，由于缺乏整體的機制系統，不能提供完全整合的視覺，這是未來需要繼續突破的地方。希望以后隨著高通量測序、基因編輯技術和小分子篩選技術的突破，尿源性iPSCs 與這些技術相結合，進一步開發遺傳病的治療干預技術，為遺傳病患者的診治帶來新的希望。