風車草對人工濕地基質微生物多樣性的影響

周俊威， 王強強， 蔡賢雷,3,4， 鄧歡歡,3,4， 李淑娟， 葛利云,3,4*

(1.溫州醫科大學 公共衛生與管理學院,浙江 溫州 325035； 2.浙江中藍環境科技有限公司,浙江 溫州 325000；3.浙南水科學研究院,浙江 溫州 325035； 4.溫州醫科大學 浙江省流域水環境與健康風險研究重點實驗室,浙江 溫州 325035)

濕地是一種過渡性地帶，處于陸生生態和水生生態兩種系統之間[1]。而人工濕地則是指通過人為手段建造的、可以調節的工程化濕地系統[2], 因其具有調節生態、效果可靠、環境友好等優點，被廣泛應用于水質凈化領域。

人工濕地根據運行中不同的水力方式，分為表面流人工濕地、垂直潛流人工濕地和水平潛流人工濕地。表面流人工濕地存在占地面積大、水力負荷小、處理能力弱、夏季易滋生蚊蟲等缺點[3]。垂直潛流人工濕地的水質凈化能力在這三種類型的人工濕地中是最強的，但是污水的水力流程較短，反硝化作用較弱，且建造成本高、運行管理復雜[4]。水平潛流人工濕地則擁有水力和污染物負荷大、處理效果好、造價及管理難度適中等優點。

濕地里的植物主要起固定基質表面、提供良好過濾條件、防止濕地堵塞和為微生物提供良好根部環境等功能[5]。在我國南方地區,濕地植物選擇范圍大,美人蕉、再力花等很多常見植物在富營養化治理生態工程中都有被應用[6],張韻[7]通過黃菖蒲、石菖蒲、梭魚草、再力花、美人蕉和風車草這6種濕地植物對受污染水體凈化能力的對比研究發現, 風車草生長快速、耐寒性好且去除率最高，更適合用于水污染治理。因此，本研究選取風車草做為實驗植物。

綜合考慮后本次實驗以人工水平潛流濕地作為研究對象，比較種植風車草和未種植風車草對人工濕地礫石表面基質微生物的影響。由于被采集樣品所處環境的不同，各組別間的微生物種類和組成可能存在部分差異[8]。微生物群落的不同也許會影響人工濕地的凈化過程，從而導致不同的凈化表現。實驗中運用高通量測序技術對細菌16S rDNA基因進行擴增并測序，比對不同人工濕地環境下微生物的多樣性，研究其菌群結構和優勢菌種，挑選出合適的人工濕地類型，并為今后的人工濕地方案設計提供參考。

1 材料與方法

1.1 處理與樣品采集

人工水平潛流濕地由PVC板搭建而成，內部填充礫石(直徑4～6 mm)構成填料基質。風車草的種植密度約為25株每平方米，該設備已運行3 a以上[9]。依照隨機均衡的原則，在人工濕地選取4個采樣點，采集樣品為礫石表面基質，同時依據是否種植風車草分別建組，將未種植風車草的人工濕地組命名為B組，樣品名為B1、B3、B7、B9，將種植風車草的人工濕地組命名為C組，樣品名為C1、C3、C7、C9。

1.2 樣品分析

取1 g樣本，采用DNA 提取試劑盒(OMEGA E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)根據使用說明進行DNA提取，同時利用微型熒光計(Turner Biosystems,TBS380) 結合DNA檢測試劑盒(Solarbio，PicoGreen)檢測提取 DNA 的濃度和純度。然后根據濃度檢測結果，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 樣品的完整性，電壓為 120 V，電泳時間約為 20 min。

選用16S rRNA V4 可變區的通用引物進行擴增，引物分別為563F (5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和802R (5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)，94 ℃預變性4 min，變性30 s，50 ℃退火30 s，循環25次，72 ℃延伸30 s，72 ℃最終延伸5 min，10 ℃終止保存。擴增結果用凝膠回收試劑盒來回收片段，委托上海派森諾生物科技有限公司進行Illumina高通量測序。

在派森諾平臺上用Flash[10]軟件進行質控，利用QIIME2[11]軟件過濾、拼接和去除嵌合體；利用RDP-classifier[12]貝葉斯算法對0.97[13]相似水平的OTU代表序列進行分類學分析；最后根據樣品OTU數據計算α多樣性獲得相關指數。

1.3 數據分析

利用STAMP[14]軟件采用Welch’s t-test進行2個組別間的統計檢驗，并繪制Extended error bar誤差線圖，分析各分類水平下組間的差異顯著性；用Excel軟件對B組和C組的多樣性指數進行單因素方差分析；用Past[15]軟件在OTU水平利用UPGMA算法采用Bray-Curtis作為相似性測度進行聚類分析，并通過ANOSIM分析檢測B組和C組的相似性。

2 結果與分析

2.1 α多樣性

在0.97分類水平上，基質樣品的α-多樣性指數如表1所示。所采集的全部樣品的微生物覆蓋率均大于94%，表明樣本內基因序列被檢出的概率很高，測序結果可靠，可以用來準確地反映樣品的情況。

表1 B組和C組樣品的多樣性指數

序列數據質控后，共獲得304 277條序列長度大于200 bp的有效序列，其中B組含優質序列153 952條，C組含優質序列150 326條，樣品的優質序列長度主要分布在223～230 bp。

從表1樣品的多樣性分析結果看，不同組別的微生物多樣性存在差異。ACE、Chao、Simpson和Shannon指數均用于描述樣品的細菌群落多樣性，指數越大，表明其群落豐富度越高[16]。細菌的多樣性和豐度指數基本與OTU數據變化相一致，C組樣品中微生物的Chao 指數、ACE指數和Shannon指數皆高于B組，且OTU數量也更多，表明C組樣品中的菌群物種較多，豐富度較高。

2.2 群落結構

表2展示了不同組別豐度占比排列前13位的門水平微生物群落分布情況。將門水平相對豐度小于0.5%的菌門歸類為其他。其中變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、綠菌門等相對豐度較高，為優勢菌群，相對豐度占比分別是37.32%、16.66%、10.95%、8.68%，占總量的73.61%。

表2 B組和C組樣品微生物門水平的相對豐度

在門和屬水平層次上對B組和C組的同類OTU聚類，進行組間顯著性差異分析并繪圖，P值小于0.05的認定為存在顯著差異，其中前15個優勢屬及優勢門詳見圖1及圖2。由圖可知，在門水平上，變形菌門的相對豐度最高，放線菌門和衣原體門具有顯著差異性；在屬水平上，綠菌屬的相對豐度最高，紅游動菌屬具有顯著差異性。

*—差異顯著(P<0.05)。圖2 同。圖1 B組和C組門水平的豐度差異性分析

圖2 B組和C組屬水平的豐度差異性分析

2.3 聚類

基于OTU數據進行聚類分析后得到圖3。樹枝的長度以及寬度分別表示不同樣品之間的距離和遠近，在相似度接近的情況下，距離會越小[17]。通過樣品的聚集樹可以表明，種植風車草組與未種植風車草組基質菌落都具有明顯的聚類特征。B組與C組OTU經相似性分析得出R值為0.458 3，P值為0.033。總體上看，種植風車草組和未種植風車草組存在差異，聚集成了2個互相獨立的大組。

圖3 B組和C組OTU水平的聚類分析

3 討論

人工濕地是城市內進行水質凈化的新興力量，人工濕地基質微生物的群落結構與多種因素有關。本實驗通過對比有無種植風車草情況下礫石表面基質生物膜的群落構成差異，運用16S rDNA 高通量測序技術對濕地基質微生物多樣性進行了探究。研究的結果顯示，風車草會對濕地基質微生物群落的組成產生影響。

3.1 風車草對人工濕地微生物多樣性的影響

本研究結果表明，種植風車草組微生物豐富度和多樣性高于未種植風車草組。這和王芬等[18]關于植物根際與非根際菌群分析的研究結論相似。濕地是碳氮循環的重要發生場所。濕地基質表面微生物的群落結構差異除與基質有關，還會受植物理化性質的影響[19-20]。植物作為影響人工濕地微生物群落結構的因素之一，除根際碳沉積作用外，根系泌氧也會對微生物碳源代謝活性產生影響[21]。植物通過將光合作用產生的氧氣輸送至根區，可在根際土壤中創造好氧環境，為微生物提供氧氣，促進微生物生長繁殖[22]。另外植物根系及其分泌物可以支持微生物的生長。相關資料表明，植物根系能釋放多種化合物, 這些物質包含高分子量的多聚糖和低分子量的有機物[23]，而這些有機物正是微生物生長繁殖所需的。因此，人工濕地微生物的多樣性與植物存在密切關聯，從而形成了不同的微生物群落特性。

3.2 風車草對人工濕地微生物群落結構的影響

2種人工濕地基質優勢菌群皆為變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門等，姜磊等[24]在對植被恢復的巖溶濕地沉積物細菌群落的研究中也有相似的結論。本實驗中，2個組別的變形菌門相對豐度平均都在35%以上且組間差異不明顯，表明變形菌門的菌類在人工濕地生態環境構筑和物質循環里發揮了重要功能，也側面論證了An等[25]關于不同類型的濕地中菌落結構具有一定相似性的觀點。另外在群落結構中進行豐度差異分析時，在門水平上，放線菌門和衣原體門的豐度在2組間具有顯著差異性。放線菌屬于革蘭氏陽性菌且具有分解纖維素的能力[26]，而植物在生長過程中會產生正常的植株枯死葉片凋落現象，為放線菌提供底物條件，這或是使其相對豐度顯著高于無植物組的原因。衣原體是一類專性真核細胞內寄生、可以在多種真核生物宿主 (包括人、動物、原蟲等) 中繁殖的無運動能力的細菌[27]。而根際內聚集的大量真菌為土壤動物提供了豐富的食物來源[28]，也因此吸引了眾多的土壤動物成為衣原體的宿主，使得衣原體門相對豐度得以提高。在屬水平上，2組間紅游動菌屬的豐度具有顯著差異。在關于裸土和種植有西洋參的根際土壤菌落研究中也存在類似現象[29]，后續研究中或可以繼續進行關注。

4 小結

植物在人工濕地系統內扮演著重要角色，且對人工濕地基質微生物組成產生了直接或間接的影響。

種植風車草可提高人工濕地基質表面微生物群落的α多樣性。

種植風車草使得人工濕地基質微生物群落組成與無種植風車草情況相比差異顯著，群落組成差異比較分析顯示：門水平放線菌門和衣原體門、屬水平紅游動菌屬在有無種植風車草情況下差異顯著。