miR-125b-5p靶向ΔNp63α對角質形成細胞分化的影響及其機制

丁毅，李敏，陳龍，張美林，馮樹梅*

1新疆醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，烏魯木齊 830011；2新疆第二醫學院基礎醫學院解剖組胚教研室，烏魯木齊 830011；3新疆醫科大學基礎醫學院技能中心，烏魯木齊 830011；4新疆烏魯木齊市中心血站，烏魯木齊 830011

皮膚是生物體遠離外界環境影響的第一道屏障，位于皮膚最外層的表皮層主要由不斷經歷自我更新、分化和退化過程的角質形成細胞組成[1-2]。角質形成細胞的異常分化與銀屑病、特應性皮炎及皮膚鱗癌等的發生關系密切[3-4]。因此，闡明角質形成細胞的分化機制對于了解皮膚疾病的發生非常重要。MicroRNAs(miRNAs)是一類內源性、長度為22～23個核苷酸的非編碼小RNA，通過與靶基因的3'非翻譯區(3'-UTR)配對來調節基因的表達[5]。多項研究發現，miRNA可調控分化、增殖和凋亡等多種重要的細胞功能，并且其表達異常與皮膚疾病密切相關[4-6]。miR-125b-5p作為一種重要的抑癌分子，在銀屑病、皮膚鱗癌和黑色素瘤中低表達，并可調節細胞凋亡，參與腫瘤的發生發展[7-8]；過表達miR-125b-5p可抑制角質形成細胞和黑色素瘤細胞的增殖[9]。ΔNp63α是皮膚發育的重要調控因子，在銀屑病和皮膚鱗癌中表達上調[10]，過表達ΔNp63α可促進角質形成細胞增殖[11]。靶基因預測發現，miR-125b-5p與ΔNp63α密切相關，但miR-125b-5p能否通過調控ΔNp63α的表達影響角質形成細胞的分化鮮見報道。本研究旨在分析miR-125b-5p和ΔNp63α對角質形成細胞分化的影響及可能機制，以期為了解皮膚病的發病機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液購自美國Gibco公司；轉染試劑riboFECTTM CP、miR-125b-5p的模擬物及抑制劑、陰性對照模擬物/抑制劑購自廣州銳博生物科技有限公司；ΔNp63α單抗(ab203826)、β-actin單抗(ab75186)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt；ab179463)、p-Akt(Ser473；ab192623)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR；ab32028)、p-mTOR(Ser2448；ab109268)購自英國Abcam公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K；sc-365290)、細胞角蛋白10(cytokeratin 10，CK10；sc-53252)、外皮蛋白(involucrin，Inv；sc-21748)、谷氨酰胺轉移酶1(transglutaminase，TG1；sc-166767)單抗購自美國Santa Cruz公司；皂素(saponin)購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自上海愛必信生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；BCA蛋白分析試劑盒和RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；ECL化學發光底物試劑盒購自中國Biosharp公司。生物安全柜和CO2培養箱購自美國Thermo Fisher公司；激光共聚焦顯微鏡(Nikon C2)購自日本Nikon公司。

1.2 細胞培養 人正常皮膚永生化角質形成細胞株HaCaT購自武漢大學中國典型培養物保藏中心，用含15%滅活胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養。

1.3 角質形成細胞分化模型的構建 取對數生長期HaCaT細胞，按照3×105個/孔接種于6孔板中，加入1.8 mmol/L氯化鈣處理0、1、5、7 d，提取RNA行qRT-PCR檢測。

1.4 細胞免疫熒光分析ΔNp63α的表達情況 取對數生長期HaCaT細胞，按照8000個/孔鋪于含細胞爬片的6孔板中，次日加入1.8 mmol/L氯化鈣處理0、5 d。用PBS清洗3次，4%多聚甲醛溶液固定15 min；PBS洗滌10 min×3次，將ΔNp63α一抗(1∶300)于saponin中稀釋后加在玻片上孵育1 h；PBS洗滌，加入二抗(1∶300)孵育1 h，PBS洗滌后封片，利用激光共聚焦顯微鏡進行共聚焦成像分析。

1.5 細胞轉染 取對數生長期HaCaT細胞，按照3×105個/孔接種于6孔板中。次日待細胞貼壁后按照如下分組進行轉染：陰性對照模擬物組(轉染陰性對照模擬物)、miR-125b-5p模擬物組(轉染miR-125b-5p模擬物)、陰性對照抑制劑組(轉染陰性對照抑制劑)、miR-125b-5p抑制劑組(轉染miR-125b-5p抑制劑)。因瞬時轉染效率僅可維持3 d左右，故在3 d后重新轉染，轉染5 d后收集細胞用于后續實驗。

1.6 qRT-PCR檢測miR-125b-5p及ΔNp63α、CK10、Inv、TG1、PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達水平利用Trizol法提取細胞總RNA，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄。PCR反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃15 s。以U6或β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達水平。引物由中國生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.7 Western blotting檢測ΔNp63α、CK10、Inv、TG1、PI3K、Akt、mTOR蛋白表達水平 取轉染陰性對照模擬物/抑制劑、miR-125b-5p模擬物/抑制劑的角質形成細胞，RIPA冰上裂解20 min，用BCA蛋白分析試劑盒進行定量檢測。蛋白質經SDSPAGE凝膠電泳后，轉移到硝酸纖維素膜(NC)上。1×TBST洗滌后，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TBST稀釋的一抗ΔNp63α(1∶1000)、CK10(1∶100)、Inv(1∶100)、TG1(1∶1000)、PI3K(1∶3000)、Akt(1∶3000)、mTOR(1∶3000)和β-actin(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔/鼠IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1 h；洗膜后用ECL試劑盒發光顯影，然后用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.8miR-125b-5p與ΔNp63α結合位點預測 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站查詢miR-125b-5p和ΔNp63α的完整RNA序列，利用bibiserv(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/)在線網站對miR-125b-5p和ΔNp63α的結合位點進行分析。

1.9 統計學處理 采用SPSS 28.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用Games-Howell檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 皮膚分化相關標志物和miR-125b-5p在氯化鈣誘導的角質形成細胞分化模型中的表達情況 qRTPCR檢測結果顯示，氯化鈣處理7 d時角質形成細胞中CK10、Inv和TG1mRNA相對表達水平(分別為300.70±13.27、9.14±1.23、5.49±0.34)高于處理0 d(分別為1.10±0.11、1.02±0.23、1.00±0.08)、1 d(分別為2.13±0.45、1.21±0.21、1.33±0.04)和5 d(分別為11.90±2.10、5.86±1.03、2.61±0.11)時，且處理5 d時高于處理1 d時，差異有統計學意義(P<0.05，圖1A)；氯化鈣處理5 d時miR-125b-5p相對表達水平(0.08±0.01)低于處理0 d(1.00±0.02)和1 d(0.17±0.02)時，差異有統計學意義(P<0.0001或P<0.05，圖1B)，但氯化鈣處理5 d與7 d(0.07±0.02)時miR-125b-5p相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 皮膚分化相關標志物和miR-125b-5p在角質形成細胞分化模型中的表達情況Fig.1 Expression of skin differentiation-related markers and miR-125b-5p in keratinocyte differentiation model

2.2 氯化鈣處理對角質形成細胞中ΔNp63α表達及PI3K/Akt/mTOR通路的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，氯化鈣處理1、5、7 d時角質形成細胞中ΔNp63α mRNA相對表達水平均高于0 d，差異有統計學意義(3.55±0.24、5.58±0.42、20.82±0.58vs. 1.01±0.23，P<0.01，圖2A)。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，與氯化鈣處理0 d時相比，氯化鈣處理5 d時角質形成細胞中ΔNp63α陽性細胞率增高，差異有統計學意義(96.9%±0.9%vs. 43.2%±8.2%，t=6.469，P<0.001，圖2B)。氯化鈣處理1 d(分別為2.28±0.05、1.66±0.04、1.77±0.22)、5 d(分別為4.37±0.22、2.42±0.05、2.47±2.22)和7 d(分別為12.77±0.59、2.88±0.20、4.39±0.33)時PI3K、Akt和mTORmRNA相對表達水平高于0 d(分別為1.00±0.11、1.03±0.05、1.00±0.05)，差異有統計學意義(P<0.05，圖2C)。

圖2 氯化鈣促進皮膚角質形成細胞中ΔNp63α的表達且激活PI3K/Akt/mTOR通路Fig.2 Calcium chloride promotes the expression of ΔNp63α and activates PI3K/Akt/mTOR pathway in keratinocyte

2.3ΔNp63α與miR-125b-5p的關系 bibiserv網站預測結果顯示，miR-125b-5p與ΔNp63α的3'-UTR區有一個結合位點(圖3)。

圖3 bibiserv網站預測皮膚角質形成細胞中miR-125b-5p與ΔNp63α的3'-UTR結合位點信息Fig.3 Prediction of 3'-UTR binding sites between miR-125b-5p and ΔNp63α by bibiserv website in keratinocyte

qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，miR-125b-5p模擬物組ΔNp63α mRNA和蛋白表達水平明顯低于陰性對照模擬物組(mRNA：0.64±0.02vs. 1.00±0.01；蛋白：0.92±0.19vs. 1.22±0.20，P<0.05，圖4A、B)；miR-125b-5p抑制劑組ΔNp63α mR NA和蛋白表達水平均高于陰性對照抑制劑組(mRNA：1.79±0.13vs. 0.99±0.01；蛋白：0.78±0.09vs. 0.60±0.11，P<0.05，圖4C、D)。

圖4 皮膚角質形成細胞中ΔNp63α與miR-125b-5p的關系Fig.4 Relationship of ΔNp63α with miR-125b-5p in keratinocyte

2.4miR-125b-5p轉染對角質細胞中皮膚分化相關標志物表達的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，miR-125b-5p模擬物組CK10、Inv、TG1mRNA和蛋白表達水平明顯低于陰性對照模擬物組(P<0.05，圖5A)；miR-125b-5p抑制劑組CK10、Inv和TG1mRNA和蛋白表達水平明顯高于陰性對照抑制劑組(P<0.05，圖5B)。

圖5 miR-125b-5p轉染對皮膚角質形成細胞中分化相關標志物表達的影響Fig.5 Effect of miR-125b-5p transfection on the expression of skin differentiation-related markers in keratinocytes

2.5miR-125b-5p轉染對角質形成細胞中PI3K/Akt/mTOR通路的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，與陰性對照模擬物組相比，miR-125b-5p模擬物組PI3K、Akt、mTORmRNA表達水平降低，PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05，圖6A)；與陰性對照抑制劑組相比，miR-125b-5p抑制劑組PI3K、Akt、mTORmRNA表達水平升高，PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05，圖6B)。

圖6 miR-125b-5p表達對皮膚角質形成細胞中PI3K/Akt/mTOR通路的影響Fig. 6 Effects of miR-125b-5p expression on PI3K/Akt/mTOR pathway in keratinocytes

3 討 論

表皮再生和動態平衡對于維持正常皮膚功能非常重要，且表皮的形成伴隨著角質形成細胞的分化、增殖和遷移。分化的基底層角質形成細胞是表皮細胞補充的主要來源[12]。角質形成細胞的異常分化與銀屑病和特應性皮炎等皮膚病相關，并與皮膚腫瘤的形成有關[13]。因此，研究角質形成細胞的分化對理解皮膚疾病的發生具有重要意義。

近年來多項研究發現，miRNA與角質形成細胞的分化、增殖和凋亡等相關。Wang等[14]發現，miR-744-3p可通過靶向KLLN抑制銀屑病中角質形成細胞的分化。在皮膚表皮層分布的miR-155過表達可明顯抑制角質形成細胞的終末分化[15]。但miRNA調控角質形成細胞分化的相關研究較少。據報道，miR-125b-5p在部分癌癥中起到癌基因或抑癌基因的作用，這可能是由于miR-125b-5p在不同組織中的靶基因不同而導致的[16]。此外，Zheng等[17]發現，miR-125b-5p在銀屑病患者皮膚中呈低表達。Lu等[18]發現，miR-125b-5p在皮膚鱗癌中呈低表達。過表達miR-125b-5p可促進皮膚鱗癌細胞的凋亡，抑制腫瘤的增長。Tian等[19]也得到了相似的結果。同時，miR-125b-5p在口腔鱗癌、頭頸鱗癌、肺鱗癌和食管鱗癌中也呈低表達[20-22]。由此可見，miR-125b-5p可能在角質形成細胞中作為一種抑癌基因而存在。本研究對角質形成細胞分化模型中miR-125b-5p的表達情況進行分析，發現miR-125b-5p的表達水平隨著角質形成細胞的分化而降低，推測miR-125b-5p可能參與角質形成細胞的分化。本研究結果顯示，miR-125b-5p模擬物組CK10、Inv、TG1的mRNA和蛋白表達水平明顯降低，且轉染miR-125b-5p抑制劑后可逆轉這一效應，提示miR-125b-5p在角質形成細胞分化過程中發揮著重要作用。采用生物信息學技術分析發現，miR-125b-5p可以與ΔNp63α的3'-UTR區結合。過表達miR-125b-5p可降低ΔNp63α mRNA和蛋白的表達水平，進一步表明miR-125b-5p抑制角質形成細胞的分化是通過下調ΔNp63α實現的。

ΔNp63α為p53家族的成員，在上皮組織分化和組織發育中發揮重要作用，且與多種腫瘤的發生發展密切相關。ΔNp63α在皮膚鱗癌、宮頸癌、肺癌組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的浸潤、轉移關系密切[23-24]。有研究發現，ΔNp63α表達水平與皮膚鱗癌患者的生存率呈負相關[23]。此外，ΔNp63α過度表達可促進皮膚鱗癌的發生和發展[25]。King等[26]發現，ΔNp63α敲除小鼠的表皮不再生長。Nylander等[27]發現，在p63敲除小鼠中過表達ΔNp63α可以恢復皮膚分化標志物的水平，并維持上皮的完整性。上述研究表明，ΔNp63α在皮膚發育中發揮著重要的調控作用。

此外，本研究證實，miR-125b-5p和ΔNp63α對角質形成細胞分化的作用可能與PI3K/Akt/mTOR通路有關。既往研究發現，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路可促進角質形成細胞的分化[28-29]。Troiano等[30]發現，在皮膚鱗癌中ΔNp63α過表達與PI3K/Akt/mTOR信號通路異常激活有關。因此，本研究評價miR-125b-5p和ΔNp63α對角質形成細胞分化的影響時，重點關注了PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用。結果表明，上調miR-125b-5p可降低角質形成細胞中PI3K/Akt/mTOR通路mRNA、總蛋白及磷酸化蛋白的表達水平，而下調miR-125b-5p則促進了PI3K/Akt/mTOR通路的激活，提示miR-125b-5p靶向ΔNp63α通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調節角質形成細胞的分化。

綜上所述，本研究結果表明，miR-125b-5p靶向ΔNp63α通過PI3K/Akt/mTOR通路抑制角質形成細胞的分化。該結果為理解皮膚疾病的發病機制提供了新的見解，并為表皮細胞生物學研究奠定了基礎。但本研究僅在體外細胞水平證實miR-125b-5p對角質形成細胞分化的影響，且ΔNp63α調控角質形成細胞分化是否與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關尚無法證實。因此，體內功能驗證及ΔNp63α的潛在機制尚需進一步研究。