+Gz暴露誘發(fā)家兔頸部骨骼肌損傷的機制研究

李卓，李曦，潘益凱，李程飛，范潔怡，鐵婭滕，趙星成，王永春

空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系航空航天醫(yī)學訓練教研室，西安 710032

頸椎病以頸椎退行性改變、頸部肌群慢性勞損為主，目前呈現(xiàn)發(fā)病率高、年輕化的臨床特點[1-2]。頸部肌群的力量相對較弱，而頸椎為脊柱中不穩(wěn)定的節(jié)段，因此頸部是人體解剖結(jié)構(gòu)中的薄弱環(huán)節(jié)。不良的體態(tài)坐姿等生活習慣會導致頸部承受更多壓力，誘發(fā)頸部病變，輕型病變涉及肌肉、韌帶等，重型病變則涉及骨骼、神經(jīng)、血管等[3]。頸椎病在戰(zhàn)斗機飛行員人群中是一種常見疾病，與其特殊工作環(huán)境關(guān)系密切[4]。現(xiàn)代高性能戰(zhàn)斗機在機動飛行中所產(chǎn)生的正加速度(+Gz)具有高G值、快增長率、持續(xù)時間長、反復出現(xiàn)等特點，使得高性能戰(zhàn)斗機飛行員在高空飛行環(huán)境中頸部不斷承受高載荷，而頭盔及各種通信裝備的附加重量也增加了頸部的負荷[5-6]，因此，易導致飛行員發(fā)生急性頸部損傷。另外，若頻繁經(jīng)受持續(xù)性高+Gz作用，則會導致頸部肌群勞損加劇，致使頸椎間盤的退行性病變提前發(fā)生[7]。但是，目前有關(guān)持續(xù)性+Gz環(huán)境暴露對頸部肌肉損傷的研究較少，頸部組織病理的發(fā)生與+Gz暴露的關(guān)系有待深入探討。本研究模擬持續(xù)性+Gz暴露環(huán)境，探討+Gz暴露誘發(fā)家兔頸部肌肉損傷的機制，以期為飛行員頸部損傷的防護與治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 活性氧(R O S，#M M-82597002)、乳酸脫氫酶(LDH，#MM-8261302)、肌酸激酶(CK，MM-33553202)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Bcl-2抗體(#15071)、IgG抗體(#7076)、Mouse IgG抗體(#7076)、Rabbit IgG抗體(#7074)購自美國CST公司；Bax抗體(ab32503)購自英國Abcam公司；GAPDH抗體(#sc-73322)購自美國Santa Cruz公司。動物離心機由空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系提供；Tanon電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)(#5200)購自上海天能科技有限公司；熒光顯微鏡(ECLIPSE C1)購自日本Nikon公司；光學顯微鏡(BX53)購自日本Olympus公司。

1.2 +Gz環(huán)境暴露動物模型及分組 健康雄性家兔20只，購自空軍軍醫(yī)大學動物中心，隨機分為正常對照組(正常飼養(yǎng)環(huán)境)、+Gz暴露組(+6 Gz環(huán)境暴露)、+Gz暴露+頸部負重組(+6 Gz環(huán)境暴露，同時對頸部施加負重)、+Gz暴露+頸部負重+固定組(+6 Gz環(huán)境暴露，同時進行頸部負重和頸腰部固定)，每組5只。家兔頸部負重方案參照飛行員頭盔占頭部重量百分比(約為30%)，確定家兔頭部負重約100 g。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學動物福利與倫理委員會批準(IACUC-20201006)，實驗過程符合國家和單位有關(guān)實驗動物的管理和使用規(guī)定。

+Gz環(huán)境模擬：采用動物離心機模擬+Gz暴露，動物離心機半徑為2 m，可模擬的+Gz范圍為+1～+12 Gz，利用半圓柱動物艙承載動物，水平固定于離心機轉(zhuǎn)臂，動物頭部朝向離心機軸心。+Gz暴露加速度G值為+6 Gz，每天連續(xù)暴露3 min，持續(xù)暴露4周(圖1)。

圖1 +Gz暴露環(huán)境及家兔頸部負重+頸腰部固定示意圖Fig.1 Schematic diagram of +Gz environmental exposure and rabbit neck loading + neck waist fixation

1.3 血液及左右側(cè)頸部斜方肌肌肉組織收集 暴露前及暴露1、2、3、4周，使用肝素抗凝管采集家兔耳緣靜脈血，1500 r/min離心，收集血漿。暴露結(jié)束24 h后，麻醉處死家兔，備皮后手術(shù)臺固定，取左右側(cè)頸部斜方肌，生理鹽水沖洗，于4%多聚甲醛溶液和液氮中保存。

1.4 X線觀察家兔頸部病變情況 暴露前和暴露4周后，耳緣靜脈注射麻醉家兔，于相同條件、相同體位下拍攝頸部側(cè)位X線片，觀察頸部病變情況。

1.5 ELISA檢測血漿LDH、CK、ROS水平 采用ELISA試劑盒檢測家兔血漿LDH、CK、ROS水平，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

1.6 HE染色觀察骨骼肌纖維形態(tài)變化 家兔肌肉組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，流水沖洗6 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，嚴格按照HE染色試劑盒說明書步驟操作，光學顯微鏡下觀察骨骼肌纖維走向、排布等形態(tài)變化。

1.7 TUNEL檢測細胞凋亡情況 嚴格按照TUNEL試劑盒說明書操作。石蠟切片進行脫蠟脫水，滴加蛋白酶K，37 ℃孵育30 min；PBS清洗5 min×5次，37 ℃下避光孵育TUNEL檢測液1 h；PBS清洗5 min×5次，封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.8 Western blotting檢測骨骼肌中凋亡相關(guān)蛋白的表達 取50 mg液氮保存的家兔斜方肌組織，加入300 μl裂解液混合物，冰浴勻漿，離心取上清，行BCA蛋白定量。采用SurePAGETM(Genscrip，#M 0 0 6 5 7)凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫下5% BSA封閉1 h，加入Bcl-2(1∶1500)、Bax(1∶1000)、GAPDH(1∶5000)一抗4 ℃孵育過夜；次日TBST清洗，加入Mouse IgG抗體(1∶8000)或Rabbit IgG抗體(1∶8000)室溫孵育1.5 h；TBST清洗，加入ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)顯影成像，使用ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.9 蛋白組學檢測及GO功能聚類分析 家兔斜方肌肌肉組織于液氮中保存，送至杭州景杰生物公司行多肽體外標記定量技術(shù)(tandem mass tags，TMT)蛋白組學檢測。使用GO數(shù)據(jù)庫(gene ontology，GO)將鑒定到的差異蛋白進行基因本體論富集分析，用于表述蛋白的各種功能屬性。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計分析并制圖。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA，Turkey法)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 +Gz暴露對家兔頸椎骨形態(tài)的影響 X線觀察家兔側(cè)位狀態(tài)下頸椎形態(tài)變化，結(jié)果顯示，與暴露前相比，各組家兔在+Gz暴露4周后，頸椎骨的生理彎曲、骨間隙等無顯著病理性改變；但與暴露前相比，暴露4周后+Gz暴露組、+Gz暴露+頸部負重組和+Gz暴露+頸部負重+固定組家兔軟組織影變深，提示肌肉等軟組織可能出現(xiàn)增厚增生變化(圖2)。

圖2 +Gz暴露對家兔頸椎骨形態(tài)的影響Fig.2 Effect of +Gz exposure on the morphology of rabbit cervical vertebrae

2.2 +Gz暴露對家兔血漿LDH、CK及ROS水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，家兔血漿LDH、CK及ROS水平與+Gz暴露時間呈正相關(guān)，+Gz暴露4周后，與正常對照組[LDH：(27.7±3) ng/ml；CK：(78.4±2.9) ng/ml；ROS：(120.8±13.6) U/ml]相比；+Gz暴露組[LDH：(37.7±1.7) ng/ml；CK：(120.2±5.3) ng/ml；ROS：(186.7±17) U/ml]、+Gz暴露+頸部負重組[LDH：(46.9±1.5) ng/ml；CK：(136.7±1.2) ng/ml；ROS：(219.1±11.5) U/ml]、+Gz暴露+頸部負重+固定組[LDH：(41.9±2.5) ng/ml；CK：(127±5) ng/ml；ROS：(208.7±5.9) U/ml]血漿LDH、CK和ROS水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且+Gz暴露+頸部負重組血漿LDH、CK及ROS水平最高(圖3)。

圖3 ELISA檢測各組家兔血漿LDH、CK及ROS水平Fig.3 Plasma levels of LDH, CK and ROS in rabbit of each group detected by ELISA

2.3 +Gz暴露對家兔頸部骨骼肌纖維形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示，正常對照組骨骼肌纖維排列緊致有序無皺褶，且走向清晰；與正常對照組比較，+Gz暴露組、+Gz暴露+頸部負重組和+Gz暴露+頸部負重+固定組骨骼肌纖維均發(fā)生扭曲紊亂；與+Gz暴露+頸部負重組比較，+Gz暴露+頸部負重+固定組骨骼肌纖維相對清晰完整，肌纖維扭曲紊亂情況有所減輕(圖4)。

圖4 +Gz暴露對家兔頸部骨骼肌纖維形態(tài)的影響(HE染色)Fig.4 Effect of +Gz exposure on the morphology of skeletal muscle fibers in the neck of rabbits (HE staining)

2.4 +Gz暴露對家兔斜方肌細胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示，+Gz暴露后，家兔斜方肌出現(xiàn)凋亡細胞；與+Gz暴露組相比，+Gz暴露+頸部負重組斜方肌TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增多(P<0.05)；與+Gz暴露+頸部負重組比較，+Gz暴露+頸部負重+固定組斜方肌TUNEL陽性細胞數(shù)有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖5A)。

Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，+Gz暴露組Bax/Bcl-2比值明顯增高(P<0.05)；與+Gz暴露+頸部負重組比較，+Gz暴露+頸部負重+固定組Bax/Bcl-2比值降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖5B)。

圖5 +Gz暴露對家兔斜方肌細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of +Gz exposure on apoptosis of neck muscle cells of rabbits

2.5 家兔斜方肌差異表達蛋白及GO功能聚類分析

為了發(fā)現(xiàn)在+Gz環(huán)境下引起家兔頸部肌肉損傷的潛在靶點，對正常對照組與+Gz暴露組進行蛋白組學篩查，以蛋白差異表達量變化超過1.3倍作為顯著上調(diào)的變化閾值，小于1.3倍作為顯著下調(diào)的變化閾值，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，+Gz暴露組中共600個蛋白發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)475個，下調(diào)125個(圖6A)；對差異蛋白進行GO功能聚類分析，結(jié)果顯示，差異蛋白顯著富集于與線粒體功能相關(guān)的蛋白，包括線粒體膜蛋白、線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白等(圖6B)。

圖6 家兔斜方肌蛋白組學分析Fig.6 Proteomic analysis of rabbit trapezius muscle

3 討 論

高性能戰(zhàn)斗機飛行員頸部經(jīng)常暴露在高慣性力作用下，具有武器瞄準、通訊、夜視等多功能的現(xiàn)代頭盔裝置改變了駕駛艙的人體工程學。頭盔系統(tǒng)重量的增加及其重心的移動增加了駕駛操作過程中移動頭部時對力量的需求，加重了+Gz負荷對頸椎和肌肉的有害影響，這使得戰(zhàn)斗機飛行員的頸部面臨更高的受傷風險，不僅慢性疲勞、慢性勞損風險增加，而且在極端飛行過程中，對頸部的急性損傷也不容忽視[8-10]。重力會影響物理和生物過程，在人體組織發(fā)育和動態(tài)平衡過程中起著關(guān)鍵作用，地球上的生命在進化過程中已經(jīng)適應了正常的重力環(huán)境，然而由于人體工作環(huán)境(高速環(huán)境、宇航環(huán)境等)的變化，微重力和超重力會對機體造成不同的影響，這已引起人們的極大關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，由于暴露在微重力或超重力的特定環(huán)境條件下，宇航員和飛行員在飛行后椎間盤退行性改變的發(fā)生率增高[11-12]。但在飛行過程中使頸部受力環(huán)節(jié)盡可能保持穩(wěn)定可顯著降低損傷率，減緩損傷發(fā)生進程。本研究觀察了+Gz暴露對家兔頸部肌肉的影響，并對家兔頭部施加負重及采用物理手段穩(wěn)定頸部，X線片顯示，在+6 Gz暴露4周后，各組家兔的頸椎形態(tài)沒有顯著差異，在此實驗條件下連續(xù)+Gz暴露未對骨骼形態(tài)造成影響。但對頸部肌肉的組織病理學、分子生物學檢測發(fā)現(xiàn)，+Gz暴露+頸部負重組較正常對照組頸部肌肉變化明顯，包括血漿CK、LDH、ROS水平增高，肌纖維紊亂，以及肌細胞凋亡增多等，而這些指標的變化反映了肌肉代謝、超微結(jié)構(gòu)的改變，提示肌肉已經(jīng)開始出現(xiàn)損傷，因此+Gz環(huán)境所引發(fā)的肌肉損傷、肌細胞凋亡應受到關(guān)注。

有研究發(fā)現(xiàn)，太空飛行會對機體生理產(chǎn)生復雜的影響，可引起體內(nèi)代謝、免疫等多方面的調(diào)節(jié)反饋，其中線粒體能量代謝、肝臟脂質(zhì)代謝等變化顯著，許多蛋白、microRNA等代謝物會影響線粒體的能量代謝，引發(fā)連鎖反應[13-14]。壓力在這些變化中起著至關(guān)重要的作用。雖然太空宇航飛行與軍事航空飛行環(huán)境不盡相同，但可以確定的是壓力、重力等特殊力學環(huán)境會對人體造成影響，引發(fā)一系列生理病理反應，細胞凋亡即為其中之一。體內(nèi)一系列生化反應都可能引發(fā)細胞凋亡，如炎癥反應、氧化應激、DNA損傷、線粒體功能紊亂等[15-17]。Bcl-2蛋白家族是與細胞凋亡高度相關(guān)的一類蛋白，該家族的一些成員(Bcl-2、Bcl-xL、Bax等)主要位于線粒體外膜上，可能通過與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)成分相互作用而調(diào)節(jié)mPTP的開放和關(guān)閉，或自身聚集形成通道，從而影響細胞凋亡[18-20]，而線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道復合物是線粒體接受各種信號的感受器，被認為是細胞生死的開關(guān)。ROS也是mPTP開放的強誘導劑，研究證實，在運動疲勞、衰老和缺血/再灌注等病理情況下均伴有呼吸鏈電子漏偏高和線粒體自由基代謝失調(diào)現(xiàn)象，過度的ROS持續(xù)積累可導致mPTP持續(xù)開放[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在+Gz暴露后，家兔血液中ROS含量明顯增加，TUNEL實驗證實了在此環(huán)境下細胞發(fā)生凋亡，通過Western blotting檢測家兔頸部肌肉中Bcl-2和Bax蛋白的表達，進一步驗證了細胞凋亡的發(fā)生。通過對正常環(huán)境和+Gz環(huán)境下兩組樣本進行蛋白組學檢測，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在較大差異，+Gz環(huán)境引起了家兔頸部肌肉蛋白表達的改變；對差異表達蛋白進行GO功能聚類分析，結(jié)果顯示，差異表達蛋白顯著富集于與線粒體功能相關(guān)的蛋白，結(jié)合前文所述，提示在+Gz環(huán)境下發(fā)生的細胞凋亡可能與線粒體功能變化高度相關(guān)，但+Gz環(huán)境所引起的蛋白變化及影響線粒體功能改變的具體機制有待進一步深入研究。

戰(zhàn)斗機飛行員人群中頸椎病是高發(fā)疾病，對飛行員的工作能力和工作狀態(tài)造成了一定影響，嚴重情況下甚至可縮短飛行員的職業(yè)生涯，造成非戰(zhàn)斗減員等損失。目前針對飛行員頸椎病的預防手段主要從兩方面考慮：一為盡量設(shè)計符合人體工程學的裝備，使頸部受力更加符合人體解剖學、運動生物力學規(guī)律，本研究結(jié)果也體現(xiàn)了穩(wěn)定頸部關(guān)鍵受力環(huán)節(jié)帶來的益處；二為飛行員日常訓練中專項強化頸腰肌群，提高對抗負荷的工作能力。目前臨床對頸椎病有手術(shù)、止痛、理療、康復訓練等多種對癥治療方法，但治療效果因人、因病情而異[24-26]。本研究通過動物實驗模擬飛行員高Gz的飛行環(huán)境，希望通過了解這一特殊環(huán)境下的肌肉損傷機制，為其治療提供新視角。本研究結(jié)果顯示，通過動物離心機模擬的+Gz環(huán)境可引起家兔頸部肌肉形態(tài)的變化，且頸部負重會惡化肌肉病變進程，而固定其主要受力環(huán)節(jié)可改善病理進程。本研究雖初步建立了+Gz環(huán)境下的動物肌肉損傷模型，通過分子生物學、組織病理學等手段觀察了其表型變化，通過蛋白組學檢測發(fā)現(xiàn)了+Gz環(huán)境這一特殊環(huán)境引起的肌肉蛋白改變，但對其關(guān)鍵作用靶點的篩選及深入驗證尚有待進一步探討。

綜上所述，+Gz暴露可引起家兔頸部肌肉損傷，導致細胞凋亡，而通過物理手段固定家兔頸部受力環(huán)節(jié)可減輕肌肉損傷；+Gz環(huán)境暴露導致的細胞凋亡可能與線粒體功能相關(guān)，但其誘發(fā)細胞凋亡的具體機制有待進一步深入研究。