卡介苗介導(dǎo)的訓(xùn)練免疫機(jī)制與作用

何樸，譚繼英，李菲，牛紅霞，祝秉東

蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物研究所，蘭州 730000

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis，M. bovis)經(jīng)過連續(xù)13年230代體外傳代培養(yǎng)后獲得的減毒活疫苗[1]。新生兒接種BCG可以預(yù)防嬰幼兒結(jié)核病，尤其是可以預(yù)防嚴(yán)重的粟粒性結(jié)核及結(jié)核性腦膜炎。此外，BCG還可以激活天然免疫，提供非特異性保護(hù)作用。

天然免疫也具有“記憶”能力。人們首先在缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的植物及無脊椎動(dòng)物中觀察到，機(jī)體被病原體初次感染或受病原相關(guān)模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)分子刺激后，激活天然免疫應(yīng)答，在病原體二次感染時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)對宿主的免疫保護(hù)能力。近期在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)，不同病原體感染后會(huì)產(chǎn)生異源性保護(hù)作用[2]。天然免疫系統(tǒng)經(jīng)病原體刺激后，對二次感染產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)的過程稱為“訓(xùn)練免疫”或“天然免疫記憶”[3-4]。BCG等病原體感染可以誘導(dǎo)天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫記憶，對其他病原體的再次感染具有抵抗作用。本文對BCG介導(dǎo)的天然免疫記憶及其產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 BCG介導(dǎo)訓(xùn)練免疫的機(jī)制

機(jī)體參與天然免疫記憶效應(yīng)的細(xì)胞主要有巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞及固有淋巴樣細(xì)胞(innate lymphoid cells，ILC)[5]。天然免疫細(xì)胞受到病原體或其他因素刺激時(shí)，由靜止?fàn)顟B(tài)被激活[6]。該表型轉(zhuǎn)變受到特定基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾等多層次的調(diào)控，而基因轉(zhuǎn)錄又受DNA甲基化及組蛋白修飾的影響[7-8]。BCG可促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞向單核巨噬細(xì)胞分化，并通過組蛋白修飾等方式促使特定基因染色質(zhì)打開，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，使以單核巨噬細(xì)胞為主的髓系細(xì)胞增多[9-10]。BCG的接種方式也對訓(xùn)練免疫效果具有較大影響。靜脈接種及黏膜免疫比常規(guī)的皮內(nèi)免疫遞送更有效，且能誘導(dǎo)更強(qiáng)的訓(xùn)練免疫[11]。

1.1 BCG促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞向髓系分化 訓(xùn)練免疫多為髓系細(xì)胞介導(dǎo)。BCG靜脈接種可促進(jìn)造血干細(xì)胞向髓系細(xì)胞分化，使巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞增多。Kaufmann等[9]發(fā)現(xiàn)，BCG刺激骨髓可以促進(jìn)短期造血干細(xì)胞及多能祖細(xì)胞群體擴(kuò)大，同時(shí)調(diào)控造血干細(xì)胞向髓系細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子Cebpe、Cebpa、Batf2及IRF8表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致髓系細(xì)胞生成增加。Cirovic等[10]發(fā)現(xiàn)，人類健康志愿者皮下注射BCG疫苗后，髓系細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)等表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)髓系細(xì)胞的分化。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用BCG免疫或結(jié)核分枝桿菌抗原ESAT-6等刺激可促進(jìn)造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Batf2、IRF8的表達(dá)上調(diào)[12]。

1.2 BCG誘導(dǎo)表觀遺傳學(xué)重編程 首先，在接種BCG后，人單核細(xì)胞會(huì)發(fā)生特異性染色質(zhì)重編程，編碼促炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)增加，促進(jìn)訓(xùn)練免疫的形成[13-14]。BCG接種引起的表觀遺傳學(xué)修飾主要包括上調(diào)組蛋白3第4位賴氨酸三甲基化(H3K4me3)、上調(diào)組蛋白3第27位賴氨酸乙酰化(H3K27ac)、下調(diào)組蛋白3第9位賴氨酸三甲基化(H3K9me3)。H3K4me3及H3K27ac可上調(diào)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α基因的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)天然免疫的產(chǎn)生。而H3K9me3可阻遏基因轉(zhuǎn)錄，因此H3K9me3下調(diào)會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，介導(dǎo)訓(xùn)練免疫。Kleinnijenhuis等[15]研究發(fā)現(xiàn)，接種BCG 3個(gè)月后，外周血CD14+單核細(xì)胞的IL-1β、TNF-α及TLR4基因啟動(dòng)子處H3K4me3顯著增加，促進(jìn)了IL-1β、TNF-α及TLR4的基因轉(zhuǎn)錄。2014年一項(xiàng)在烏干達(dá)開展的隨機(jī)雙盲對照試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種BCG的嬰兒外周血IL-1β等促炎性細(xì)胞因子啟動(dòng)子處H3K4me3增加，H3K9me3減少，促炎性細(xì)胞因子表達(dá)增高[16]。接種BCG后單核細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的H3K27ac顯著升高，促進(jìn)了促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，使機(jī)體的抗病毒能力增強(qiáng)，能減輕黃熱病病毒疫苗引起的病毒血癥[16]。BCG免疫促使髓系細(xì)胞活化后，即便初次感染消除，這些穩(wěn)定的表觀修飾(即甲基化或乙酰化)仍然保留。由于這些固有免疫細(xì)胞基因處于打開狀態(tài)，能夠?qū)υ俅未碳ぷ龀龈鼜?qiáng)烈的反應(yīng)(圖1)[17]，因此，BCG介導(dǎo)的訓(xùn)練免疫可以維持較長時(shí)間。

圖1 BCG介導(dǎo)訓(xùn)練免疫形成Fig.1 BCG mediates the formation of training immunity

其次，BCG接種可激活髓系細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)及轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)等轉(zhuǎn)錄因子。激活的轉(zhuǎn)錄因子與促炎或抗炎基因的增強(qiáng)子及啟動(dòng)子結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制細(xì)胞因子的分泌[18]。BCG刺激中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)分子活化，同時(shí)使促炎性細(xì)胞因子的基因啟動(dòng)子H3K4me3增加，染色體打開，天然免疫激活，增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞對白色念珠菌的殺傷作用[19]。

最后，組蛋白表觀遺傳修飾受相關(guān)酶活性及長鏈非編碼RNA(lncRNAs)的調(diào)節(jié)。賴氨酸特異性甲基轉(zhuǎn)移酶(KMT)及脫甲基酶(KDM)介導(dǎo)的組蛋白甲基化修飾可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄[20-21]。端粒沉默-1-樣蛋白(Dot1L)是H3K79的甲基轉(zhuǎn)移酶，它可以選擇性地結(jié)合IL-6及IFNB1啟動(dòng)子，并促進(jìn)H3K79甲基化。Dot1L沉默會(huì)造成H3K79甲基化減少，從而減少巨噬細(xì)胞分泌的IL-6及IL-1β[22]。在單核細(xì)胞的訓(xùn)練免疫反應(yīng)過程中，lncRNAs通過三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與天然免疫相關(guān)基因結(jié)合，從而將伴侶蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(WD repeat domain 5-mixed lineage leukemia1，WDR5-MLL1)引導(dǎo)至靶基因啟動(dòng)子處，促進(jìn)H3K4me3募集到靶基因啟動(dòng)子處[23]，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

1.3 代謝改變與表觀遺傳重編程的相互作用

1.3.1 糖酵解與表觀遺傳重編程 BCG誘導(dǎo)的單核細(xì)胞糖酵解速率加快與Akt/mTOR途徑有關(guān)。BCG可以誘導(dǎo)Akt及mTOR磷酸化增加，使用mTOR抑制劑雷帕霉素處理后，BCG介導(dǎo)的以細(xì)胞因子增加為主的訓(xùn)練免疫減弱或消失。研究發(fā)現(xiàn)，BCG主要通過上調(diào)mTOR及4種谷氨酸代謝必需酶(HK2、PFKP、GLS、GLUD)啟動(dòng)子處H3K4me3，以及下調(diào)上述基因啟動(dòng)子處H3K9me3，使mTOR糖酵解及谷氨酰胺代謝4種必需酶的mRNA表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)單核細(xì)胞的糖酵解反應(yīng)。同時(shí)，雷帕霉素還可以逆轉(zhuǎn)BCG介導(dǎo)的單核細(xì)胞TNF-α及IL-6啟動(dòng)子處的表觀遺傳學(xué)改變，使上調(diào)表達(dá)的H3K4me3減少，下調(diào)表達(dá)的H3K9me3增加，表明代謝與表觀遺傳重編程相關(guān)[24]。

1.3.2 BCG通過糖酵解調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化 M1型巨噬細(xì)胞以糖酵解和乳酸代謝為主，而M2型巨噬細(xì)胞則更多地依賴氧化磷酸化和脂質(zhì)代謝。對訓(xùn)練免疫的細(xì)胞進(jìn)行代謝表征研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BCG誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型，再次刺激時(shí)糖酵解增加，乳酸生成增多。使用糖酵解抑制劑(如雷帕霉素)后，基因啟動(dòng)子處的表觀遺傳學(xué)變化消失[25]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制糖酵解和谷氨酰胺代謝可導(dǎo)致琥珀酸積累，使BCG的訓(xùn)練免疫作用減弱[26]。

1.3.3 代謝中間體影響表觀遺傳修飾相關(guān)酶活性代謝中間體可以充當(dāng)染色質(zhì)修飾酶的底物、輔因子或抑制劑[27]。糖酵解增強(qiáng)可導(dǎo)致三羧酸循環(huán)底物延胡索酸積累，后者可通過調(diào)控Akt/mTOR信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)上調(diào)糖酵解基因的表達(dá)及IL-1β的產(chǎn)生[28]。此外，糖酵解中間產(chǎn)物可調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)修飾。延胡索酸可抑制組蛋白去甲基化酶及去乙酰化酶的活性[29]。單核細(xì)胞組蛋白乙酰化需要代謝途徑的中間體乙酰輔酶A[30]。

2 BCG誘導(dǎo)的非特異性免疫作用

BCG接種會(huì)激活外周單核細(xì)胞及NK細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，對其他病原體感染產(chǎn)生非特異性保護(hù)[31-32]。

2.1 抗微生物感染的非特異性保護(hù)作用 BCG接種可引起機(jī)體產(chǎn)生以細(xì)胞因子為主的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對細(xì)菌、病毒及寄生蟲的非特異性防護(hù)。在印度尼西亞及日本開展的針對BCG接種人群的保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，接種BCG的老年人群急性上呼吸道感染及肺炎的發(fā)病率均有不同程度的下降。新生兒接種BCG可降低出生后第一年的死亡率[16,33-34]。BCG免疫后，肺泡吞噬細(xì)胞(alveolar phagocyte，APs)表面高表達(dá)T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白4(T cell immunoglobulin domain and mucin domain 4，TIM4)，吞噬殺傷作用增強(qiáng)。用致死劑量的甲型流感病毒攻擊BCG免疫小鼠，所有小鼠均能獲得保護(hù)[35]。給C57BL/6小鼠鼻內(nèi)接種BCG后，能促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生，降低黃熱病病毒疫苗引起的病毒血癥發(fā)生率[16](表1)。以上研究提示，接種BCG后，機(jī)體對其他細(xì)菌及病毒感染也能產(chǎn)生非特異性保護(hù)。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種BCG能增強(qiáng)機(jī)體抗寄生蟲感染的能力，對小耳巴貝蟲、伯氏瘧原蟲、弓形蟲及克氏錐蟲等產(chǎn)生保護(hù)性免疫[37]。

表1 BCG對部分病毒感染的防護(hù)作用(改編自Moorlag等[36])Tab.1 Protective effect of BCG against partial virus infection (Adapted from Moorlag et al.[36])

2.2 抗腫瘤的非特異性免疫 BCG對于膀胱癌、黑色素瘤等腫瘤具有抑制及治療作用，目前仍被列為Ⅲ期黑色素瘤的治療藥物[38]。BCG能活化天然免疫，有助于激活腫瘤特異性CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-1及IL-2，形成Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，介導(dǎo)抗腫瘤作用[38]。膀胱灌注BCG可以激活膀胱上皮細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子及趨化因子，募集中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，進(jìn)而吞噬并殺傷腫瘤細(xì)胞[39]。將BCG直接注射到黑色素瘤病灶中，可通過激活TLR2、TLR4、TLR8及TLR9，分泌TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)及IL-12p40等細(xì)胞因子，活化巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及NK細(xì)胞，殺傷黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞[40]，病灶消退率高達(dá)

65%[41]。

3 BCG在新冠肺炎防治中的應(yīng)用

2019年末，由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球流行并傳播。面對COVID-19的大暴發(fā)，迫切需要提高人群的免疫反應(yīng)，BCG通過表觀遺傳學(xué)誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫可能具有潛在的保護(hù)作用。

2021年，一項(xiàng)來自全球160多個(gè)國家及地區(qū)的Meta分析結(jié)果顯示，BCG接種覆蓋率超過70%，BCG接種與COVID-19感染減少有關(guān)[42]。在很多國家，BCG作為預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染的疫苗被強(qiáng)制接種。目前已經(jīng)確認(rèn)，在實(shí)施BCG接種計(jì)劃的國家，每百萬人群中COVID-19的感染及死亡人數(shù)均低于未實(shí)施BCG疫苗接種計(jì)劃的國家。2020年，紐約理工學(xué)院開展的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在沒有普及BCG接種政策的國家，COVID-19感染的嚴(yán)重程度是其他國家的10倍，病死率也很高[43]。在歐洲COVID-19大流行的第1個(gè)月，BCG指數(shù)與COVID-19病死率之間存在顯著的線性相關(guān)，BCG指數(shù)每增加10%，COVID-19病死率降低10.4%[44]。當(dāng)然，BCG對COVID-19保護(hù)效果的評價(jià)受多方面因素的影響，造成不同研究結(jié)果間存在較大差異。這些因素包括人口及遺傳結(jié)構(gòu)的差異、采取的非藥物干預(yù)措施的差異(如隔離或社交距離)、COVID-19診斷的差異以及所處流行階段的不同等[45]。以上多項(xiàng)研究結(jié)果均提示BCG接種對COVID-19具有保護(hù)作用。然而，BCG接種引起的免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間，何時(shí)接種BCG，BCG早期接種比二次接種是否具有更好的保護(hù)效果依然是亟待解決的問題，需要更多的機(jī)制研究來揭示BCG介導(dǎo)的訓(xùn)練免疫與COVID-19防護(hù)的關(guān)系。

老年人群是SARS-CoV-2感染引起嚴(yán)重癥狀的主要群體。衰老造成老年人天然免疫系統(tǒng)防御功能降低，而且老年人適應(yīng)性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生缺陷，缺乏B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞，因此，老年人難以抵抗SARS-CoV-2感染[46]。有研究表明，老年人接種BCG也可形成良好的訓(xùn)練免疫[47]，可能有助于降低SARS-CoV-2感染率及病死率，但尚缺乏確切證據(jù)。

綜上所述，較多相關(guān)研究間接支持了BCG的保護(hù)作用，但結(jié)論多偏于假設(shè)，還需要進(jìn)一步的詳細(xì)研究來確認(rèn)。

4 總結(jié)與展望

經(jīng)BCG誘導(dǎo)，機(jī)體的天然免疫細(xì)胞可通過表觀遺傳及代謝重編程誘導(dǎo)模式識(shí)別受體表達(dá)，促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子分泌，提供非特異性保護(hù)。訓(xùn)練免疫導(dǎo)致天然免疫細(xì)胞發(fā)生長期變化，從而使宿主對再次刺激產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。訓(xùn)練免疫早于淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性免疫記憶，構(gòu)成機(jī)體防御的免疫防線[48]。目前對于BCG誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫機(jī)制仍不夠明確。蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及表觀基因組學(xué)的發(fā)展將使人們能夠揭示訓(xùn)練免疫的潛在新特征。BCG介導(dǎo)訓(xùn)練免疫的研究為疫苗設(shè)計(jì)提供了新思路。BCG誘導(dǎo)天然免疫的能力及其對特異性免疫保護(hù)作用的影響值得深入研究。