洋蔥黃矮病毒的實時熒光RT-PCR檢測方法

劉建青 王韜遠 李小宇 張春雨 蘇 穎 魏 健 張金花* 王永志*

（1 吉林省農業科學院，吉林公主嶺 136100；2 長春師范大學生命科學學院，吉林長春 130032；3 蕪湖職業技術學院，安徽蕪湖 241000）

洋蔥黃矮病毒（Onion yellow dwarf virus，OYDV）是一種隸屬于馬鈴薯Y 病毒屬（）的單鏈正義RNA 病毒，可侵染大蒜、洋蔥等多種經濟作物，嚴重危害蔥屬植物的產量和品質（許蕊，2012；王永志 等，2018）。OYDV 于1929 年首次在美國愛荷華州的洋蔥中被發現（Melhus et al.，1929）。國內于2018 年在吉林省分蘗洋蔥（又稱珠蔥、毛蔥或分蘗蔥頭）中首次發現該病毒（Su et al.，2018）。OYDV 主要通過蚜蟲傳播，也可以汁液摩擦接種傳播，還在少數地方品種中存在種子傳播（Kumar et al.，2011；Katis et al.，2012）。OYDV 感染蔥屬植物后，存在于感病植株的根、葉和鱗莖等各個部位（李金娟 等，2011），表現為植株矮化，葉片伴隨局部不規則發黃，后期整個葉片發黃和皺縮等癥狀（Winiarczyk et al.，2014）。珠蔥和大蒜主要以鱗莖進行無性繁殖，長期的無性繁殖使病毒逐代傳遞和積累，尤其是OYDV 危害較大，導致種性退化，給當地種植戶造成了嚴重的經濟損失（董玉惠 等，2019；蘇雪嬌 等，2021）。

目前沒有防治病毒病的有效藥劑，建立精準高效的病毒檢測技術是防治的重要前提。目前常用的OYDV 檢測方法主要有血清學法和分子生物學法（高昌勇和尚宏芹，2004）。酶聯免疫吸附法（ELISA）是目前常用的血清學檢測方法之一（王永志 等，2018），但該方法耗時較長，靈敏度較低，易誤檢（王鵬 等，2013；陶源和吳興泉，2017）。而分子生物學法可以彌補以上缺點，OYDV 的分子生物學檢測技術主要包括常規RT-PCR 檢測法（郭炎 等，2019）和逆轉錄環介導等溫擴增法（RTLAMP）（Tiberini et al.，2019a）等，但上述兩種方法不能對病毒進行定量分析。而實時熒光RT-PCR方法具有高靈敏度和可定量等優點，已成為植物病毒檢測的重要技術手段之一（丁天波 等，2018）。本試驗根據OYDV 外殼蛋白（coat protein，）基因保守序列設計特異性引物，通過優化反應體系和反應條件，建立OYDV 實時熒光RT-PCR 檢測方法，以期為OYDV 的監測預警和蔥屬植物病毒病防治提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

2020 年6 月初在吉林省珠蔥和大蒜種植區采用五點取樣法隨機采集90 份疑似OYDV 感病樣品，其中珠蔥45 份，大蒜45 份，編號后置于液氮中速凍，之后于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：TRIzol 購自Invitrogen 公司，快速質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司，MagicSYBR Mixture 試劑盒購自北京康為世紀有限公司，1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMD18-T Vector Cloning Kit、DNA Marker 和DH5α感受態細胞均購自大連寶生物公司（TaKaRa）。

主要儀器：QuantStudio6 Flex 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司，高速冷凍臺式離心機（CT15RE 型）購自日本日立公司，基因擴增儀（ETC-811 型）購自東勝創新生物技術有限公司，電泳儀（DYY-11 型）購自北京市六一儀器廠，凝膠成像儀購自美國WEALTET 公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank 中登錄的OYDV基因保守序列設計一對特異性引物，擴增目的片段長度為79 bp。上游引物OYDV-F：5′-GCACGTTACGCATTC GACTT-3′，下游引物OYDV-R：5′-GCCTTCAT CTGCATGTGTG-3′，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 OYDV 實時熒光RT-PCR 檢測方法的建立

1.4.1 質粒標準品的制備 采用TRIzol 法提取OYDV 染病葉片總RNA，-80 ℃冰箱中保存。根據1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書合成cDNA第一鏈，并以其為模板，使用OYDV-F/R 引物進行常規RT-PCR 擴增。20 μL PCR 反應體系：上下游引物（10 μmol·L）各0.5 μL，Premix Ex10 μL，模板cDNA 1 μL，加ddHO 補足20 μL；擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行驗證。

將初步驗證正確的PCR 產物經膠回收純化，連接至pMD18-T 載體并轉化DH5 α 感受態細胞，篩選并提取陽性克隆質粒送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。利用核酸蛋白濃度測定儀測定重組質粒濃度，根據公式：拷貝數=（質粒濃度 × 10× 6.02 × 10）/（質粒總長度 × 660）計算陽性重組質粒拷貝數，按10 倍梯度稀釋質粒，-20 ℃保存。

1.4.2 反應條件優化 以陽性質粒標準品為模板，依次對引物濃度、退火溫度等進行優化。20 μL 反應體系：2× MagicSYBR Mixture 10 μL，上、下游引物分別設0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L共5個引物濃度，ROX Reference Dye 0.2 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 補齊至20 μL。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，退火/延伸30 s（分別設58、60、62 ℃共3 個退火溫度），40 個循環。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，以熔解曲線峰單一且循環閾值（Ct 值）最小為標準，確定最佳反應體系和反應條件。

1.4.3 標準曲線建立 以終濃度為2.0 × 10～2.0 × 10copies·μL的陽性質粒標準品為模板，每個濃度重復3 次，利用優化后的反應條件進行實時熒光RT-PCR 擴增，建立標準曲線。

1.4.4 特異性試驗 應用建立的實時熒光RT-PCR方法對青蔥X 病毒（Shallot virus X，SVX）和蔥潛隱病毒（Shallot latent virus，SLV）進行檢測，同時設濃度為2.0 × 10copies·μL的標準品為陽性對照，以ddHO為陰性對照，驗證該方法的特異性。

1.4.5 敏感性試驗 以終濃度為2.0～2.0 × 10copies·μL的陽性質粒標準品為模板分別進行實時熒光RT-PCR 和常規RT-PCR 擴增，比較兩種方法的靈敏度。

1.4.6 重復性試驗 以終濃度為2.0 × 10～2.0 × 10copies·μL的陽性質粒標準品為模板分別進行組內和組間重復性試驗，每個梯度設3 個重復，評價其重復性。

1.5 田間樣品檢測

以田間采集的90 份珠蔥和大蒜待測樣品cDNA為模板分別進行常規RT-PCR 和實時熒光RT-PCR 檢測，同時以健康植株為陰性對照，比較兩種方法的檢測結果。

2 結果與分析

2.1 質粒標準品的制備

以感染OYDV 的珠蔥葉片總RNA 反轉錄合成的cDNA為模板擴增OYDV基因部分片段，結果顯示，引物OYDV-F/R 能擴增出79 bp 的目的片段，與預期大小相符（圖1）。將目的片段回收純化，連接于pMD18-T 載體上，提取質粒，經測序分析和BLAST 比對，確定所獲得的序列為OYDV基因片段。利用核酸蛋白濃度測定儀測定重組質粒濃度為66.7 ng·μL，根據公式計算陽性重組質粒拷貝數為2.0 × 10copies·μL。

圖1 RT-PCR 擴增OYDV 目的片段

2.2 OYDV 實時熒光RT-PCR 檢測方法的建立

2.2.1 反應條件優化 當引物終濃度為0.2 μmol·L，退火溫度為60 ℃時，熔解曲線峰單一且Ct 值最小，因此，經反應條件優化得到最佳反應體系：2× MagicSYBR Mixture 10 μL，上、下游引物（10 μmol·L）分別為0.4 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 7 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。

2.2.2 標準曲線建立 以終濃度為2.0 × 10～2.0 × 10copies·μL的質粒標準品為模板，進行實時熒光RT-PCR 擴增，得到Ct 值與標準品拷貝數的對數所構建的標準曲線（圖2）。結果顯示，Ct 值與模板拷貝數的對數呈良好的線性關系，=-3.424+41.21，擴增效率（E）為95.921%，相關系數（R）為0.996。

圖2 OYDV 實時熒光RT-PCR 標準曲線

2.2.3 特異性試驗 利用建立的實時熒光RT-PCR檢測方法，以SVX 或SLV 侵染珠蔥的cDNA為模板，檢測結果顯示（圖3），僅OYDV 出現特異性擴增，而SVX、SLV 及陰性對照均未出現特異性擴增，表明該方法具有較高的特異性。

圖3 OYDV 實時熒光RT-PCR 特異性分析

2.2.4 敏感性試驗 以終濃度為2.0～2.0 × 10copies·μL的質粒標準品為模板分別進行實時熒光RT-PCR 和常規RT-PCR 擴增。結果顯示：在Ct 值＜35 范圍內實時熒光RT-PCR 的檢出下限為2.0 × 10copies·μL（圖4-A），而常規RT-PCR的檢出下限為2.0 × 10copies·μL（圖4-B）。表明本試驗建立的實時熒光RT-PCR 檢測OYDV 的靈敏度比常規RT-PCR 大約高1 000 倍。

圖4 OYDV 實時熒光RT-PCR 和常規RT-PCR 敏感性分析

2.2.5 重復性試驗 將不同稀釋度標準品2.0 × 10～2.0 × 10copies·μL進行實時熒光RTPCR擴增，結果顯示（表1），組內變異系數在0.17%～0.41%，組間變異系數在0.31%～1.84%之間，均小于2%，表明該方法具有良好的重復性。

表1 OYDV 實時熒光RT-PCR 重復性試驗

2.3 田間樣品檢測

利用常規RT-PCR 和本試驗建立的實時熒光RT-PCR 方法對采集的各45 份疑似OYDV 感病珠蔥和大蒜樣品進行檢測，常規RT-PCR 檢測結果表明：珠蔥和大蒜陽性樣品分別為16 份和42 份，陽性檢出率分別為35.56%和93.33%。實時熒光RTPCR 檢測結果顯示：珠蔥和大蒜陽性樣品分別為34 份和45 份，檢出率分別為75.56%和100.00%，較常規RT-PCR 分別高40.00、6.67 百分點。

3 討論與結論

洋蔥黃矮病毒是導致蔥屬植物病毒病發生的主要病毒之一，在我國東北、華中和西北等地區均有發生，給當地種植戶造成嚴重經濟損失（孫新艷 等，2016；李甜甜 等，2017；李小宇 等，2019）。在種植過程中，OYDV 在鱗莖中不斷積累，嚴重影響鱗莖的營養成分和儲藏特性，干擾蔥屬植物的代謝途徑（Tiberini et al.，2019b）。由于該病毒主要通過多種蚜蟲以非持久性方式進行傳播，具有較高的傳播流行風險（Drake et al.，1993），因此，在田間需加強媒介昆蟲的防控，及時清理田間雜草和拔除感病植株，防止病毒的蔓延。

病毒檢測對病毒流行病學研究及脫毒種苗繁育具有重要意義。在植物的整個生長周期，病毒在植物的不同組織部位及不同生長階段含量不同，在病毒含量極低時進行檢測容易出現假陰性（Conci et al.，2002），因此，需要確定最佳采樣部位和檢測時間。OYDV 感染洋蔥后，葉片中的病毒含量始終高于鱗莖（Sevik，2012），因此本試驗選取珠蔥和大蒜葉片作為檢測材料，進行OYDV 實時熒光RT-PCR 擴增，陽性檢出率高于常規RT-PCR，適用于蔥屬植物脫毒苗脫毒效果的檢測。蔥屬植物通常感染OYDV 等多種病毒，目前已建立針對洋蔥和大蒜寄主的OYDV 實時熒光RT-PCR 檢測方法（陳輝麟，2014；Tiberini et al.，2019b），本試驗針對珠蔥寄主，進一步完善了利用實時熒光RTPCR 法檢測不同寄主感染OYDV 的情況，但建立的實時熒光RT-PCR 方法主要針對單一病毒，有待進一步建立多重實時熒光RT-PCR 檢測體系，縮短檢測時間，提高檢測效率。

OYDV 常與其他病毒復合侵染蔥屬植物，如OYDV 與SLV 復合侵染大蒜和珠蔥（Majumder &Joshi，2008；劉建青 等，2021），與蔥屬X 病毒屬病毒復合侵染洋蔥（Kumar et al.，2010）。兩種病毒復合侵染同一寄主時，它們之間可能發生干擾或協生作用，不同的作用方式將會對寄主植物癥狀、媒介昆蟲與植物相互作用產生不同的影響（李舒，2016）。本試驗建立的OYDV 實時熒光RT-PCR 方法不僅為田間珠蔥和大蒜病毒定性檢測提供了技術手段，還可用于監測OYDV 在珠蔥和大蒜的不同組織部位的積累量、檢測寄主植物的抗性和研究不同感染階段病毒-媒介昆蟲-寄主植物的互作機制，有利于尋找更有效的抗病毒途徑，對于當地珠蔥和大蒜生產及產業發展具有重要意義。