越南伯克霍爾德氏菌B418配合噻唑膦提高對黃瓜根結線蟲的防控效果

扈進冬 魏艷麗 王貽蓮 劉寶軍 李紀順

〔齊魯工業大學（山東省科學院）山東省科學院生態研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東濟南 250103〕

根結線蟲是世界上危害植物健康最嚴重的寄生線蟲之一，目前已知對5 500 多種植物的生長發育及生產構成威脅，其中包括糧食作物、蔬菜作物及經濟作物等（Trudgill &Blok，2001；Jones et al.，2013）。在我國南方根結線蟲（）、花生根結線蟲（）、爪哇線蟲（）和北方根結線蟲（）4 種根結線蟲分布比例最高（Castagnone-Sereno et al.，2013；Fan et al.，2020）。伴隨著我國保護地蔬菜的迅猛發展，黃瓜、番茄等根結線蟲危害日趨嚴重，給農業生產造成了嚴重損失。北方保護地黃瓜生產中根結線蟲以南方根結線蟲為主，一旦發生常導致黃瓜嚴重減產，甚至絕產，是影響黃瓜生產的重要病害之一（彭德良，1998；成惠珍 等，2004；賈美清和吳光紅，2011）。然而目前市場上可供選擇的殺線劑主要以噻唑膦、阿維菌素、棉隆為主，在很多地方已經產生了嚴重的抗藥性（劉曉艷 等，2021）。農民為了防治根結線蟲病，實際的化學殺線劑使用量也逐漸增加，不但增加了防治成本，而且也易產生藥害、農藥殘留和環境污染（紀春濤 等，2010；Davies &Spiegel，2011；Sergio，2011），同時，防治效果和產量也提高有限。由于化學防治的局限性，以及人們環境保護、食品安全意識的提高，生物防治已被認為是化學防治的一種有益補充及替代方法。在生物防治措施中，微生物拮抗劑是一種很有前景的防治植物病害的生物制劑，也越來越受到人們的廣泛關注（Sharifazizi et al.，2017；Vega，2018）。目前已報道的植物寄生線蟲生防微生物資源有淡紫擬青霉251、堅強芽孢桿菌I-1582、厚垣輪枝孢ZK7（Li et al.，2015）、長枝木霉T6（Zhang et al.，2017）、橘綠木霉Snef 1910（Fan et al.，2020）、越南伯克霍爾德氏菌B418（陳凱 等，2011）等，其中多株優良生防菌株已被開發為生物殺線劑產品。

越南伯克霍爾德氏菌B418 是山東省科學院生態研究所環境微生物研究室保存的一株多功能生防菌株，除具備防治植物根結線蟲病的作用，還兼有解磷、解鉀、固氮、促生等功能，并已在農業部登記為微生物肥料產品（王貽蓮 等，2014）。在以往的試驗中主要單獨使用，對線蟲的防治效果還不甚理想，因此本試驗擬通過小區試驗測定越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦使用對黃瓜根結線蟲的田間防治效果及產量的影響，為黃瓜根結線蟲病的科學防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和藥劑

越南伯克霍爾德氏菌B418（CGMCC No.1212）由山東省科學院生態研究所環境微生物實驗室保存，液體發酵后制備成粉狀菌劑（活菌含量5 × 10cfu·g）備用。10%噻唑膦顆粒劑（河北三農農用化工有限公司產品）按1∶9 比例與細沙混合備用。

1.2 土壤樣品采集與土壤DNA 提取

2021 年在山東省泰安市岱岳區明泰農豐科技（泰安市）有限公司大棚采集土壤樣品，該棚棚齡11 年，土壤類型為棕壤。試驗棚劃分小區后，每小區按照五點取樣法取樣，采集0～20 cm 的表層土，將5 點采集的土壤混合均勻作為1 個土樣。室溫條件下風干，取500 g 風干后土樣氣流粉碎機粉碎后稱取0.5 g 土壤樣品，利用DNeasy Power Soil DNA Isolation Kit（Qiagen，Valencia，CA）試劑盒，按照說明書提取土壤DNA，最終洗脫體積為100 μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量和濃度后，用于土壤樣品中根結線蟲的熒光定量PCR檢測。

1.3 熒光定量PCR 分析

采用毛小芳等（2004）改良的貝爾曼漏斗法分離土壤中根結線蟲二齡幼蟲，并在顯微鏡下挑取1 000 條二齡幼蟲，提取線蟲基因組DNA，并將其梯度稀釋，制成1 000、100、10、1、0.1 條線蟲的標準品，根據南方根結線蟲的ITS區（NCBI FJ534 516.1）ITS1部分保守序列，設計南方根結線蟲特異性引物MIITS7-F（5′-CCAATTTAATCGCAGTGGCTTG）和MIITS 127-R1（5′-CGACAGCCGTTTCACAACAATA）進 行PCR 擴增。依據循環閾值（Cq 值）與根結線蟲二齡幼蟲的對數值之間的線性關系，建立標準曲線。土壤樣品中根結線蟲的種群密度根據標準曲線計算獲得。

qPCR 采用二步法，擴增反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，共40 個循環；循環結束后，樣品加熱到95 ℃保持1 min，立刻降至60 ℃保持5 s，然后每5 s 提高0.5 ℃遞增到95 ℃，建立熔解曲線。qPCR 反應體系（20 μL）：10 μL 2× SG Fast qPCR Master Mix 預混液〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕，20 μmol·L引物MIITS7-F和MIITS127-R1 各1 μL，DNF Buffer 2 μL，土壤DNA 樣品1 μL，超純水補足20 μL，每個土壤DNA 樣品3 次重復。

1.4 防治黃瓜根結線蟲的田間試驗方案

2020 年11 月至2021 年3 月在泰安市大汶口鎮北藤村多年連作種植的黃瓜棚，進行黃瓜根結線蟲防治試驗，每茬黃瓜根結線蟲病株率在90%以上。供試黃瓜品種為金禾1912，購自山東金禾農科種業有限公司。在黃瓜移栽前采用1.2 和1.3 的方法測定各小區土壤中根結線蟲的種群密度，并根據土壤中線蟲的種群密度將各小區分為線蟲輕度、中度和重度小區3 種類型，其中線蟲輕度小區8 個，中度小區8 個，重度小區4 個。小區面積13.5 m（9 m × 1.5 m），每小區定植60 株黃瓜。試驗共設置4 個處理：越南伯克霍爾德氏菌菌劑（每穴9 g）、10%噻唑膦顆粒劑（每穴3 g）、復合處理（越南伯克霍爾德氏菌菌劑每穴9 g+10%噻唑膦顆粒劑每穴3 g）和空白對照，每處理設置5 個小區，2 個小區在線蟲輕度小區，2 個在線蟲中度小區，1 個在線蟲重度小區，同一類型小區內各處理完全隨機排列。在黃瓜定植時，先將越南伯克霍爾德氏菌菌劑和10%噻唑膦顆粒劑施入定植穴內，和定植穴內土壤均勻混合后移栽黃瓜幼苗，定植后各小區管理操作一致，試驗期間不施用防治根結線蟲的其他藥劑。

在黃瓜定植后60 d 每小區隨機挖取5 株黃瓜，參照Bridge 和Page（1980）的方法，對各處理根系樣品的根結進行分級，并計算根結病情指數和防效（Wei et al.，2014），定植后105 d 將剩余黃瓜植株全部挖出，按前述方法進行根系根結分級并計算根結病情指數和防效。在定植后60 d 和90 d 時分別對各小區進行產量測定，每次測產連續測定3 d，然后將3 d 的產量之和作為1 次測產結果。定植后105 d 隨機選取5 株黃瓜，挖取植株根系，并用清水小心沖洗后晾干，記錄主根上分出的側根數量。

1.5 數據統計與分析

采用Excel 2010 軟件對數據進行整理、使用SPSS statistics 20.0 統計分析軟件進行統計分析，不同處理樣品采用Duncan 新復極差法（＜0.05）分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 小區土壤中根結線蟲的種群密度

依據Cq 值與根結線蟲二齡幼蟲的對數值之間的線性關系，建立根結線蟲標準曲線（圖1）。并據此測定了田間試驗中不同處理的25 個小區土壤中根結線蟲的種群密度，圖2 顯示熔解峰單一表明qPCR 產物特異性好，結果可以較好地反映土壤中南方根結線蟲的種群數量。本試驗測定的小區中每1 kg土壤中的根結線蟲數量在15.8～408.4條之間，從25 個小區中選取20 個作為試驗小區，選取每1 kg 土壤中的根結線蟲數量在0～50 條之間的小區定為線蟲輕度小區組，共8 個小區；將每1 kg 土壤中的根結線蟲數量在51～200 條之間的小區定為線蟲中度小區組，共8 個小區；將每1 kg 土壤中的根結線蟲數量在201～400 條之間的小區定為線蟲重度小區組，共4 個小區。

圖1 南方根結線蟲數量對數值與Cq 值間的擬合曲線

圖2 土壤基因組DNA 樣本qPCR 擴增的熔解曲線

2.2 不同藥劑處理對黃瓜根結線蟲病的防效

黃瓜定植后60 d 的測定結果表明（表1），在線蟲輕度、中度和重度小區中越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理的根結線蟲病情指數為1.06～5.20，對根結線蟲的平均防效達72.50%，與10%噻唑膦（平均防效68.47%）或單一越南伯克霍爾德氏菌B418 菌劑（平均防效63.29%）施用相比，防效有一定程度的提升，但差異不顯著（以單獨計算的線蟲輕度、中度和重度小區的防效作為重復進行統計，下同）。

黃瓜定植后105 d 的測定結果表明（表1），在線蟲輕度、中度和重度小區中越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理的根結線蟲病情指數為3.87～13.84，對根結線蟲的平均防效達63.99%，與10%噻唑膦（平均防效58.34%）或單一越南伯克霍爾德氏菌B418 菌劑（平均防效57.08%）施用相比，具有顯著的增效作用（＜0.05）。

2.3 不同藥劑處理對黃瓜產量的影響

不同藥劑處理對黃瓜產量的影響如表2 所示，根據定植前土壤線蟲種群密度劃分的輕度小區、中度小區和重度小區之間黃瓜產量差異非常大。黃瓜定植后60 d 時測產，線蟲重度小區對照產量為3.20 kg，低于3 種類型小區對照的平均產量（3.58 kg），而且重度小區的對照病情指數（15.42）也是3 種類型小區中最高的（表1），說明從定植后60 d開始根結線蟲已經對黃瓜產量產生影響。至定植后90 d 時，線蟲重度小區對照的產量僅為0.65 kg，說明根結線蟲已嚴重影響產量。越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理則可以更好地降低根結線蟲對黃瓜產量造成的損失，在定植后60 d 時，越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理與對照相比增產48.10%～101.56%，在定植后90 d 時增產達95.65%～392.31%，其增產效果明顯優于單一越南伯克霍爾德氏菌B418 或單一噻唑膦處理；在定植后60、90 d 時增產率分別較單一噻唑膦處理提高8.86～71.87 百分點和21.74～230.77 百分點，在線蟲重度小區增產尤為明顯。說明越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理具有協同增效作用，在防治根結線蟲病的同時能有效減少線蟲危害造成的黃瓜產量損失。

表1 不同藥劑處理對黃瓜根結線蟲病情指數和防效的影響

表2 不同藥劑處理對黃瓜產量的影響

2.4 不同藥劑處理對黃瓜根系的影響

在定植后105 d 時從不同處理組中隨機挑選5株黃瓜，如圖3 所示，越南伯克霍爾德氏菌B418配合噻唑膦處理的根系側根明顯增多。其中，對照平均側根數5.1 條·根，但根結數較多；噻唑膦處理雖然根結數比對照少但平均側根數僅為4.2 條·根；越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理的平均側根數則為10.4 條·根，同時根結數也比對照少；單一越南伯克霍爾德氏菌B418 處理平均側根數為6.2 條·根，根結數介于對照和越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理組之間。說明雖然噻唑膦處理可以有效防治根結線蟲，但同時也會影響植株的根系生長發育，從而影響黃瓜產量，而越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦處理則可以改善單一噻唑膦處理對植株生長的這種負面影響，有助于黃瓜產量的提高。

圖3 定植后105 d 不同處理對黃瓜根系的影響

3 結論與討論

本試驗針對土壤中線蟲種群密度分布不均勻的問題，改進了小區試驗的隨機區組設計，首先采用qPCR 測定了每個小區土壤中根結線蟲數量，并按土壤中根結線蟲的種群密度將小區劃分為線蟲輕度、中度、重度3 個不同等級；然后，再將不同處理隨機排列到不同等級小區中，病情指數和防效在同等級小區內測定，克服了直接隨機排列可能出現的不同處理的小區線蟲種群密度差異大對結果造成的不利影響。以對照為例，從表1 的結果可以看出，2 個線蟲輕度小區黃瓜定植后105 d 時對照的病情指數為12.05 和25.28，而線蟲重度小區則為38.24，差距較大。這也說明即使在同一蔬菜大棚中，根結線蟲的發生也常不均一，呈島狀分布。所以，按土壤中根結線蟲的種群密度將小區劃分成不同等級，同等級小區之間進行比較結果才更準確。此外，紀春濤等（2010）發現化學殺線劑雖然可以減少線蟲對植株的為害，但也會對植株根系發育造成影響，從圖3 可以看出，噻唑膦處理后植株側根數量明顯比對照及使用生防菌劑的處理少，因此，植株營養吸收也會相應減弱，表2 的產量結果也進一步印證了上述結果，在黃瓜定植后90 d 時噻唑膦處理組產量明顯低于越南伯克霍爾德氏菌B418配合噻唑膦處理組，在線蟲重度小區上述趨勢尤為明顯。

綜上所述，采用越南伯克霍爾德氏菌B418 配合噻唑膦防治黃瓜根結線蟲病，與單一噻唑膦處理或單一越南伯克霍爾德氏菌B418 處理相比，在不同線蟲種群密度小區中均顯示出更佳的防病和增產效果，具有協同增效作用，不但增強了對黃瓜根結線蟲病的防治效果，還促進了植株根系發育，提高了黃瓜產量。