相關環狀RNA與漢族2型糖尿病發生風險的關系研究

康潔紅，常向云，朱余蓉，巴濤，孫媛

糖尿?。―M）是一組由于胰島素分泌絕對或相對不足，或外周組織對胰島素不敏感而引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。根據國際糖尿病聯盟（IDF）公布數據，每年有超過1億人被診斷為DM，目前全世界有4.63億成年DM患者，按照增長趨勢到2045年全球將有7億DM患者[1-2]。2型糖尿?。═2DM）患者易出現嚴重并發癥，給個人、家庭、社會帶來巨大負擔。LI等[3]于2015—2017年進行的全國第6次DM流行病學調查表明，不同民族之間DM患病率存在較大差異，其中漢族DM患病率最高（12.8%），回族最低（6.3%）。喬曉玲等[4]綜述了表觀遺傳學可通過抑制胞吐過程對T2DM第一時相胰島素分泌產生影響，中國T2DM患者存在遺傳易感性，基因組攜帶的遺傳信息分為兩類：遺傳編碼信息和表觀遺傳信息[5]。表觀遺傳學是指基于非DNA序列改變所致的基因表達水平變化，如染色質重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化、X染色體失活、非編碼 RNA（noncoding RNA，ncRNA）調控等[6]；ncRNA調控是表觀遺傳學的重要組成部分，主要包括microRNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA和環狀RNA（circular RNAs，circRNAs）等[7]。circRNAs是新近確認的一類特殊的非編碼RNA分子，其在表達模式上具有組織特異性及細胞特異性，生物發生受特定順式作用元件及反式作用因子的調節。circRNAs具有高度穩定性、特異性和敏感性等特點，且便于檢測，使其可成為糖尿病診斷和預測的潛在生物學標志物[8]。一些circRNAs還具有豐富性和進化保守性，以及較高的抗外切酶或核糖核酸酶降解的能力[9]。MEMCZAK等[10]報道表明，circRNAs與T2DM的發生、發展有密切關系，本研究通過從新疆維吾爾族T2DM[11]患者中篩選出的差異表達明顯的4個候選circRNAs（hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922）在漢族T2DM患者中進行觀察，探討4個候選circRNAs在漢族T2DM患者中表達水平的變化及其作為生物標志物的潛在價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年9月至2021年6月在石河子大學醫學院第一附屬醫院內分泌代謝科及健康體檢中心就診或體檢的漢族T2DM患者（T2DM組）及漢族健康者（健康對照組）。納入標準：（1）長期居住在新疆，三代內未與其他民族通婚；（2）未合并冠心病、心肌病、惡性腫瘤、肝臟、腎臟疾病，以及急、慢性感染性疾病，未服用激素類、精神藥物或類固醇類藥物；（3）T2DM診斷符合1999年世界衛生組織制定的糖尿病診斷標準[12]，未使用胰島素進行降糖治療；（4）T2DM組與健康對照組性別、年齡相匹配。最終納入T2DM組21例，其中男12例、女9例，年齡43～63歲，平均年齡（53.9±5.0）歲；健康對照組22例，其中男11例、女11例，年齡44～63歲，平均年齡（54.9±6.1）歲。本研究征得所有研究對象的知情同意，患者均簽署知情同意書；經石河子大學醫學院第一附屬醫院科技倫理委員會批準，倫理審批編號KJ2020-134-01。

1.2 研究方法 收集研究對象一般資料，包括性別、年齡，測定身高、體質量、血壓，抽取研究對象清晨空腹外周靜脈血常規送檢于石河子大學醫學院第一附屬醫院檢驗科，使用DT4-1B-24孔醫用水平離心機以4 000 r/min離心10 min，離心半徑15.6 cm，吸取離心管內上清液12 μl，根據BECKMAN COULTER AU5800系列全自動生化分析儀使用說明書測定空腹血糖（FPG）、果糖胺（FA）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）；采用羅氏COBAS 8000型電化學免疫分析儀測定空腹胰島素（FINS）、空腹C肽（CpS）。計算胰島素穩態模型指數（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。另外抽取外周靜脈血5 ml，EDTA抗凝，于4 h內提取單核細胞，取EDTA管內1 ml外周靜脈血加3 ml紅細胞裂解液（1∶3）置于離心管內充分混勻，室溫靜置10 min，以4 000 r/min離心5 min，離心半徑為12.3 cm，管底可見大量白色細胞沉淀，棄去上清液，再次加入1～3 ml紅細胞裂解液混勻，以4 000 r/min離心3 min，離心半徑12.3 cm，棄去上清液，管底白色沉淀物按照TRIZOL試劑盒（美國Invitrogen公司）說明書，提取血單核細胞的總RNA。

采用RT-PCR方法檢測各組樣本中候選circRNAs（hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922）水平，反應體系為40個循環，先95 ℃變性1 s，再把溫度降到60 ℃、31 s進行延伸反應，以管家基因ACTB（β-actin）作為內參照，每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數為CT值，circRNAs相對表達水平用2-ΔΔCT表示，所有樣本重復3次，取平均值，2-ΔΔCT越高，circRNAs表達水平越高。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料的分析采用χ2檢驗；采用多元線性回歸分析探究circRNAs與T2DM臨床生化指標的關系；采用Logistic回歸模型估計circRNAs的2-ΔΔCT變化時漢族T2DM患病風險的改變量，同時繪制受試者工作特征（ROC）曲線，通過ROC曲線下面積（AUC）判斷候選circRNAs對T2DM的診斷價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料、生化指標及候選circRNAs相對表達水平比較 健康對照組和T2DM組性別、年齡、體質指數（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FINS、CpS、HOMA-IR、LDL-C、HDL-C比 較， 差異均無統計學意義（P＞0.05）；T2DM組FPG、FA及hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922相對表達水平均高于健康對照組，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634均低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組一般資料、生化指標及4個候選circRNAs相對表達水平比較Table 1 Comparison of general information，biochemical indicators and relative expression levels of four candidate circRNAs in T2DM Han Chinese and healthy Han Chinese

2.2 多元線性回歸分析探究circRNAs與糖代謝相關指標的關系 以4個候選circRNAs的相對表達量為因變量，對所有入組人群使用前進法逐步引入糖代謝相關指標FPG、FA、Log2FINS、CpS為自變量進行多元線性回歸分析，結果顯示，hsa_circ_0005414 2-ΔΔCT=1.835-0.171×FPG，R2=0.290；hsa_circ_0139634 2-ΔΔCT=1.878-0.438×FA，R2=0.159；hsa_circ_0032491 2-ΔΔCT=3.808+0.876×FPG-1.023×Log2FINS，R2=0.503；hsa_circ_0002922 2-ΔΔCT=0.170+0.281×FPG，R2=0.168，見表2。

表2 多元線性回歸分析探究circRNAs與糖代謝相關指標的關系Table 2 Multiple linear regression analysis of the association of four candidate circRNAs with glucose metabolism related indicators in Han Chinese

2.3 候選circRNAs診斷T2DM的ROC曲線分析繪制候選circRNAs診斷T2DM的ROC曲線，結果顯示，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922診斷T2DM的AUC分別為0、0.199、0.968、0.844，見表3、圖1。

表3 候選circRNAs診斷T2DM的價值分析Table 3 Analysis of the value of four candidate circRNAs for the diagnosis of T2DM in Han Chinese

圖1 候選circRNAs診斷T2DM的ROC曲線Figure 1 ROC curve analysis of four candidate circRNAs in predicting T2DM in Han Chinese

2.4 候選circRNAs相對表達水平與漢族T2DM關聯性的Logistic回歸分析 以是否患有T2DM為因變量（賦值：是=1，否=0），以hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922 相對表達量為自變量，行單因素Logistic回歸分析，結果顯示，hsa_circ_0139634相對表達水平升高可降低T2DM的患病風險（P＜0.05），hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922相對表達水平升高可增加T2DM的患病風險（P＜0.05），見表4。對單因素Logistic回歸分析存在影響的基因進行多因素Logistic回歸分析顯示模型建立無法成立。

表4 候選circRNAs相對表達水平與漢族T2DM關聯性的單因素Logistic回歸分析Table 4 Univariate Logistic regression analysis of the association of three candidate circRNAs with T2DM in Han Chinese

3 討論

circRNAs被認為是一類特殊的非編碼RNA，沒有5′端帽和3′端尾，是由mRNA反向剪接產生的共價閉合RNA分子，富含miRNA結合位點，具有miRNA海綿作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，這一機制被稱為競爭性內源性RNA（ceRNA）機制[10，13]。有研究表明 circRNAs可直接影響其宿主基因啟動子區域的表觀遺傳狀態，如乳腺癌細胞中的癌基因FLI1不僅可通過典型的癌蛋白途徑轉移，還通過其外顯子介導的表觀遺傳機制驅動腫瘤轉移[14]。YANG等[15]在T2DM中構建lncRNA-circRNAs-miRNA-mRNA網絡機制表明單個lncRNA和circRNAs可與多個miRNA相關，然后共同調控更多的mRNA，且lncRNA和circRNAs在T2DM中起中心調控作用。

雖然近年來大量的circRNAs被發現和研究，且很多研究均表明circRNAs與T2DM的發生、發展密切相關，如ZHAO等[16]通過微陣列分析發現T2DM患者和正常對照者外周血circRNAs存在差異表達譜，并通過大樣本驗證了hsa_circ_0054633的靈敏度及特異度；王思思等[17]通過生物信息學技術篩選了與胰島素信號通路相關的3個circRNAs，研究發現在T2DM患者血清中has_circ_0056891、has_circ_0063425、has_circ_0071336表達水平降低，調整多個因素后再次進行統計學分析，結 果 提 示 has_circ_0056891、has_circ_0063425、has_circ_0071336在T2DM中表達水平降低，是T2DM的獨立預測因子，可能在T2DM及空腹血糖受損（IFG）的發病機制中起重要作用。徐文超等[18]研究發現在T2DM患者外周血中hsa_circ_401724表達顯著上調，并通過分析得出其可能通過靶miRNAs調控相關信號通路參與T2DM的發生、發展。LIMOGE等[19]研究表明存在VPS13B基因缺陷的細胞，其脂肪細胞分化會加速，導致脂肪蓄積增加，胰島素反應提示存在異常。寧利俐等[20]探討了我國成年隱匿性免疫性糖尿?。↙ADA）患者外周血circRNAs表達譜，研究結果表明hsa_circ_100670302、hsa_circ_0035809在LADA患者與健康者中存在明顯的表達差異，hsa_circ_100670302的基因VPS13B與胰島素抵抗（IR）相關，與健康者比較，LADA患者hsa_circ_100670302表達上調，推測hsa_circ_100670302可能通過調控VPS13B基因影響糖尿病的發生、發展，hsa_circ_0035809在T2DM、LADA患者中明顯下調。綜上所述，hsa_circ_100670302、hsa_circ_0035809可能成為區分LADA和健康個體的新型生物學標志物。同時也有研究表明circRNAs與糖尿病型心肌病、血管內皮功能障礙、糖尿病足、糖尿病視網膜病變、糖尿病合并抑郁癥均密切相關[21-26]。

circRNAs在T2DM中的具體作用機制仍不十分明確，查閱近幾年國內外相關文獻，關于hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922與漢族T2DM之間關聯未見報道，本研究選取 hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在漢族T2DM中進行觀察，結果表明hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在漢族 T2DM組和健康對照組中表達水平存在明顯差異，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634在漢族T2DM組中表達水平下降，將其對漢族T2DM進行診斷價值分析，發現上述2個候選基因對漢族T2DM無明顯診斷價值，但通過單因素Logistic回歸分析可知hsa_circ_0139634相對表達水平升高可降低T2DM的患病風險，可以推測hsa_circ_0139634雖對漢族T2DM無診斷價值但卻是漢族T2DM的獨立預測因子，通過其基因表達水平的變化可以預測漢族T2DM的患病風險，從而做到提早預防，進行生活方式干預，提高漢族T2DM的早期診斷率；而hsa_circ_0005414對漢族T2DM既無診斷價值，與其患病風險也無相關性，但卻在漢族T2DM患者中表達水平低下，有待學者進一步研究；hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在漢族T2DM患者中表達水平明顯上調，以hsa_circ_0032491最為顯著，將表達上調基因對漢族T2DM的診斷價值進行分析，根據AUC提示其可作為早期診斷漢族T2DM較好的生物學標志物，同時進行單因素Logistic回歸分析可知其相對表達水平升高可增加漢族T2DM 的患病風險，同樣可作為預測因子，且hsa_circ_0032491可根據臨床檢測FPG、FINS水平初步評估其基因相對表達水平，從而對漢族中有潛在患T2DM的人群進行早期患病風險評估，提早進行生活方式干預，可在一定程度上減緩T2DM的進展。而hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922與miRNA之間是否存在關聯及其在漢族T2DM中的作用機制如何將會是后續研究的主要方向。

本研究也存在不足，選取的漢族T2DM患者未區分是否為首次診斷，也缺乏對糖耐量異常人群進行研究，同時入選例數過少，后續可進一步擴大樣本量觀察；在研究結果中T2DM組與健康對照組的FINS、CpS均無統計學差異，考慮是由于選取T2DM組研究對象時患者尚未使用胰島素降糖治療，研究對象只單純存在胰島素調控葡萄糖代謝能力的下降，尚未進展到胰島β細胞功能缺陷所導致的胰島素分泌減少。此外，本研究是單中心的橫斷面研究，研究對象的地理位置比較集中，其他地區的人口是否也有類似的基因表達譜，目前尚不十分清楚，隨著病程的延長基因表達水平是否存在差異也不十分明確。因此，本研究結果需要在更大樣本、更多樣化的人群中行進一步觀察和隨訪。相信闡明circRNAs在漢族T2DM中的具體作用機制會將DM的診斷及治療帶進全新的領域。

作者貢獻：康潔紅提出研究思路及主要研究目標，參與試驗操作，進行統計學處理及繪制圖表，負責撰寫論文；巴濤、孫媛參與部分試驗操作；常向云、朱余蓉負責文章的質量控制，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。