線粒體DNA D-環區單核苷酸多態性與胃癌發病年齡的關系研究

王英南，吳忱思，趙樂，張風賓，張韶辰，郭占軍，張瑞星*

胃癌（gastric cancer）是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，發病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居惡性腫瘤第4位，嚴重威脅著人們的生命健康[1]。中國更是胃癌大國，據2020年研究數據表明，中國每年新發病例45.7萬，死亡病例30.0萬，無論發病人數還是死亡人數，均居全球第1位，防控形勢嚴峻[2]。目前研究表明，大多數國家40歲及以上人群的胃癌發病率在下降，而在40歲以下人群中胃癌發病率逐漸上升，且年輕胃癌患者具有起病隱匿、進展迅速、淋巴轉結移早、腹膜轉移率高、預后差等特點，給家庭、社會造成重大影響[3-4]。因此迫切需要探索預測胃癌發病年齡的相關因素及機制，以期在特定人群中采取更多的預防策略，降低胃癌發病率。

胃癌的形成是一個多基因、多因素參與的過程，近年來發現胃癌的發生不僅與核基因的變化相關，還與細胞核外遺傳物質線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突變及單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）關系密切。人類mtDNA是哺乳動物細胞內唯一的核外遺傳物質，由于其特殊的性質，例如缺乏組蛋白的保護以及修復系統不完善，與核內基因組相比，mtDNA更容易發生突變[5-6]。D-環區（D-Loop區）作為 mtDNA轉錄調控位點，具有高度不穩定性，在包括胃癌等多種惡性腫瘤的研究中發現，D-Loop區是mtDNA突變和多態性的熱點區域[7-9]。這些突變和多態性可能抑制線粒體電子傳遞鏈的傳導，導致大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放，不斷刺激細胞增殖分化，最終誘發腫瘤[10]。為進一步防控胃癌，本研究對胃癌患者外周血中的mtDNA D-Loop區進行測序分析，分析其與胃癌患者發病年齡的關系，以期尋找預測發病年齡的指標，從而針對特定人群進行早期預警及干預。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2007年7月至2008年12月在河北醫科大學第四醫院消化內科就診并經胃鏡病理證實的各期胃癌患者150例作為研究對象。排除標準：合并其他部位腫瘤；病理類型為鱗癌、腺鱗癌、神經內分泌癌等其他病理類型。本研究經河北醫科大學第四醫院倫理委員會批準（MEC2008-2），患者均對本研究知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集患者的臨床特征，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度、TNM分期等。采集所有患者空腹外周靜脈血，即刻放置在-4 ℃冰箱中恒溫保存。

1.2.2 mtDNA提取、PCR擴增及基因測序 采用美國Promega公司生產的全血線粒體萃取試劑盒迅速提取mtDNA后置于-80 ℃恒溫保存。經定量鑒定合格后的DNA，采用聚合酶鏈反應（PCR）法擴增目的片段，上游引物為：5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3'，下游引物為：5'-GCTTTGAGG AGGTAAGCTAC-3'。應用PCR預混試劑（Promega，Madison，WI，美國）、PCR儀（AS Applied Biosystems 9902，美國）進行分析，PCR具體反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38個循環，最后于72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠純化后，采用ABI PRISM? BigDye Terminator v3.1循環測序反應試劑盒進行DNA測序。同一標本采用雙向、測通、重復測序。

1.3 觀察指標 分析不同臨床特征胃癌患者發病年齡，胃癌患者mtDNA D-Loop 區SNPs與發病年齡之間的關系，以及胃癌患者發病年齡影響因素。

1.4 統計學方法 采用SPSS 24.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制胃癌患者發病年齡的生存曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗；胃癌患者發病年齡的影響因素分析采用多因素Cox比例風險回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征胃癌患者發病年齡比較 150例胃癌患者中，＜40歲6例（4.0%），40～50歲19例（12.7%），51～60歲49例（32.7%），＞60歲76例（50.6%）。不同性別、腫瘤大小、腫瘤部位、TNM分期患者發病年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同分化程度患者發病年齡比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同臨床特征胃癌患者發病年齡比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of age at onset in gastric cancer patients with different characteristics

2.2 胃癌患者mtDNA D-Loop 區SNPs與發病年齡之間的關系 將150例胃癌患者mtDNA D-Loop區的測序結果與人類mtDNA文庫記錄的劍橋序列進行比對，共發現106個多態位點，將最小等位基因頻率＜5%的位點剔除，共得到21個SNPs位點進一步分析，分別是位點73A/G、146T/C、150C/T、152T/C、153A/G、195T/C、199T/C、204T/C、249A/del、263A/G、309C/CC、489T/C、523-524AC/del、16261C/T、16290C/T、16298T/C、16304T/C、16311T/C、16319G/A、16362T/C、16519T/C。采用Kaplan-Meier法繪制胃癌患者發病年齡的生存曲線，采用Log-rank檢驗分析mtDNA D-Loop區SNPs與患者發病年齡之間的關系，結果顯示153A/G與患者發病年齡有關，153G基因型患者的平均發病年齡為（48.0±5.3）歲，153A基因型患者為（60.1±0.8）歲，153G基因型患者的發病年齡早于153A基因型患者，差異有統計學意義（χ2=7.757，P=0.005），見圖1；其他位點SNPs與患者發病年齡的關系比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 mtDNA D-Loop區SNPs位點153A/G胃癌患者發病年齡的生存曲線Figure 1 Survival curves associated with the age at onset for gastric cancer patients according to the 153A/G polymorphism in mitochondrial D-Loop

2.3 胃癌患者發病年齡影響因素的多因素Cox比例風險回歸分析 以胃癌患者發病年齡（賦值：實測值）為因變量，以性別（賦值：男=0，女=1）、mtDNA D-Loop區153位點（賦值：G基因型=0，A基因型=1）為自變量進行多因素Cox比例風險回歸分析，結果顯示，mtDNA D-Loop區SNPs位點153A/G是預測胃癌患者發病年齡的影響因素（P＜0.05），見表2。

表2 胃癌患者發病年齡影響因素的多因素Cox比例風險回歸分析Table 2 Multivariate Cox regression analysis of possible predictors associated with the age at onset of gastric cancer

3 討論

胃癌的發病率和死亡率長期居高不下，嚴重威脅著人們的生命健康。雖然近幾十年來胃癌的發病率逐漸下降，但年輕胃癌患者的發病率和死亡率均在增加[11]。各項研究對年輕胃癌患者的年齡定義和納入標準不同，年輕胃癌患者常被定義為年齡＜40歲或＜45歲，以40歲為年齡界限，胃癌發病率從1973年1.7%的最低點增加至2015年的3.5%[12-14]。本研究中＜40歲的胃癌患者所占比例為4%，與上述研究一致[12]。年輕胃癌具有侵襲性強、擴散快、預后不良等特點，且在病理組織分型中，以低分化腺癌、印戒細胞癌為主。HUANG等[14]篩查了3 000余例胃癌患者，結果發現年輕胃癌女性患者所占比例明顯高于男性，并與Lauren彌漫型和較低的腫瘤分化有關。本研究同樣發現發病年齡小的患者腫瘤分化程度較低，提示發病年齡小的患者腫瘤惡性度更高，更容易給家庭、社會造成疾病負擔，因此迫切需要深入探討預測胃癌發病年齡的因素及相關機制，以期早干預、早預防，降低年輕胃癌發病率。

胃癌的發病機制目前仍不十分清楚，可能是環境和遺傳因素共同作用的結果，但有研究顯示在年輕胃癌患者致病因素中，基因發揮的作用可能比環境致癌的影響更大[15]。線粒體是細胞內重要的細胞器，在細胞的新陳代謝、自由基產生、細胞凋亡、信號傳導等多種生理過程中發揮著重要作用。由于mtDNA改變，包括突變、SNPs和拷貝數變異等引起的線粒體功能障礙可導致癌癥、衰老和其他多種疾病的發生和發展[16]。D-Loop區是mtDNA的非編碼區，其區域內包含重鏈復制起始點及重鏈、輕鏈轉錄的啟動子，是mtDNA復制和轉錄的調控中心。D-Loop區的突變可影響線粒體功能，并在各種癌癥中被廣泛發現[17-19]。本課題組前期研究中已經發現mtDNA D-Loop 區的SNPs與胃癌的發病及預后相關[20-21]。本研究發現mtDNA D-Loop區的SNPs與胃癌患者的發病年齡相關，153G基因型患者的平均發病年齡為（48.0±5.3）歲，153A基因型患者為（60.1±0.8）歲，153G基因型患者較153A基因型患者發病年齡明顯偏早，進一步多因素Cox比例風險回歸分析顯示mtDNA D-Loop區SNPs位點153A/G是預測胃癌患者發病年齡的影響因素。LEE等[22]研究發現，mtDNA D-Loop區16311位點的多態性可作為家族性乳腺癌患者發病年齡的預測因素，16311C基因型患者較16311T基因型患者發病年齡早。KONG等[23]研究也發現，mtDNA D-Loop區248位點、524位點和16304位點的多態性與卵巢癌患者的發病年齡有關，248G、16304T基因型患者較248A、16304C基因型患者的發病年齡早，而524C基因型患者發病年齡晚于524C缺失的患者。上述研究結果均表明，mtDNA D-Loop區SNPs顯示出了作為新型的預測腫瘤發病年齡的指標的潛力。同時本研究也存在一些不足，在多因素Cox比例風險回歸分析中，未納入幽門螺桿菌感染狀態、飲食、飲酒等其他影響胃癌發病年齡的因素，將在今后的研究中進一步完善。

新近研究顯示，線粒體作為啟動和調節代謝的細胞器，其功能障礙長期以來一直被認為是導致衰老和與年齡有關的疾病的主要因素[24-25]。由于mtDNA易受到氧的作用，其較核基因更易發生突變，在衰老和與年齡相關的疾病中mtDNA不斷出現點突變和缺失，隨著mtDNA突變的不斷積累，編碼線粒體內膜中呼吸鏈的酶受到阻礙，使呼吸鏈功能下降，進一步導致更多自由基的產生，最終誘發細胞衰老[24-25]。在細胞衰老過程中，ROS和氧化應激產物不斷增加，增加的ROS一方面可作為毒性分子加劇線粒體損傷，誘導體細胞mtDNA突變，導致線粒體氧化呼吸鏈損傷，形成惡性循環；另一方面ROS還可作為第二信使參與多種信號通路，調控基因表達，參與腫瘤細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲及轉移等多個生物學過程[26-27]，這也是導致腫瘤發病率會隨著年齡的增加而增加的重要原因之一。本研究發現的與胃癌發病年齡相關的SNPs位點153位于D-Loop高變2區（HV2，63-322np），此區域的突變可能直接影響著mtDNA的復制并引起氧化呼吸鏈的改變，導致高水平的ROS釋放，大量的ROS刺激細胞不斷增殖分化，并誘發原癌基因成為癌基因，最終導致腫瘤的發生。此外，此區域的突變可能引發線粒體呼吸能力的下降，從而引發細胞衰老，這也在一定程度上解釋了為什么mtDNA D-Loop區的SNPs會與胃癌患者發病年齡相關，但153位點多態性的具體功能尚不十分清楚，仍需進一步探索。

綜上所述，mtDNA D-Loop區SNPs位點153A/G可能作為胃癌發病年齡的新型預測指標，這有助于識別早期發病的胃癌患者，以便早期給予干預及預防，降低胃癌發病率。

作者貢獻：王英南提出研究選題方向，進行文章的構思與設計，負責數據收集、采集、清洗和統計學分析；王英南、吳忱思、趙樂、張風賓負責撰寫論文初稿；吳忱思、趙樂、張風賓、張韶辰負責數據收集、采集、清洗和統計學分析、繪制圖表，論文修訂；郭占軍、張瑞星進行數據復核，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責；所有作者確認了論文的最終稿。

本文無利益沖突。