輪狀病毒NSP1和NSP3蛋白真核表達載體構建、表達及其調控Ⅰ型干擾素信號通路的功能

李鳳迪，王嘉瑞，劉新宇，黃海巖，葉麗萍，曾 艷，曹 欣

(1.西北民族大學生物醫學研究中心，生物工程與技術國家民委重點實驗室，蘭州 730030；2.西北民族大學生物醫學研究中心，甘肅省動物細胞技術創新中心，蘭州 730030；3.西北民族大學生命科學與工程學院， 蘭州 730030；4.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林省動物微生態制劑工程研究中心，長春 130118)

【研究意義】輪狀病毒(Rotavirus, RV)屬呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，基因組由11段dsRNA組成，共編碼12種蛋白，包括6種結構蛋白(VP1～VP4,VP6及VP7)和6種非結構蛋白(NSP1～NSP6)[1-2]。其中結構蛋白構成病毒的3層衣殼，而非結構蛋白影響病毒的復制和基因表達調控過程[3]。輪狀病毒是引起幼兒和動物幼畜病毒性腹瀉的重要病原體[4-5]。結合RV的基因組結構和抗原性將其分為7個組即A～G，其中A～C組能引起人畜感染，D～G組主要引起動物感染，而A組輪狀病毒又是導致幼兒和動物幼畜腹瀉的主要病原體。人和動物在感染輪狀病毒后，輕者癥狀為嘔吐、厭食、腹瀉、脫水等，嚴重者可導致死亡[6-7]?！厩叭搜芯窟M展】NSP1蛋白由RV的第5段基因編碼，在RV蛋白質組中保守程度最低，不同來源毒株的NSP1差異較大。NSP1通過多種途徑拮抗干擾素應答。NSP1通過蛋白酶體途徑可使IRF3快速降解，缺乏IFN啟動子活性[8-9]。NSP3蛋白通常由RV7，8或9基因片段編碼，具體的基因片段與病毒株的種類有關，一般由313個氨基酸殘基組成，為非糖基化蛋白。Trujillo-Alonso等[10]研究發現輪狀病毒感染誘導了UPR(Unfolded protein response，未折疊的蛋白反應)，而UPR在翻譯水平上被病毒非結構蛋白NSP3抑制。這種反應似乎是由病毒復制周期中合成的病毒產物觸發的，更有可能是由一種或多種病毒蛋白合成的，而不是由病毒dsRNA觸發的，與谷鳳麗等[3]從感染RV的MA104細胞裂解物中分離得到具有復制酶活性的NSP3，都表明NSP3可能在病毒的復制和形態中起重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】本文對猿輪狀病毒SA11株病毒的NSP1和NSP3的基因進行克隆和真核表達載體構建，基于雙熒光素酶報告基因系統判定NSP1和NSP3蛋白對IFN-β/ISRE報告基因活性的影響，初步確定NSP3蛋白對IFN-I信號通路的調控功能。【擬解決的關鍵問題】輪狀病毒NSP3蛋白對IFN-I信號通路的調控作用初探，為研究NSP3蛋白如何拮抗宿主IFN-I抗病毒反應的分子機理提供研究材料和奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 細胞系、載體和菌種 人胚腎上皮細胞(HEK293T)由吉林省動物微生態制劑工程研究中心保存；pRK-Flag載體、pRK-HA載體、pUCm-T載體由本實驗室保存，感受態菌種為大腸桿菌DH5α菌種。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶、PBS磷酸鹽緩沖液、青霉素—鏈霉素溶液(雙抗)、胎牛血清(FBS)、各種限制性內切酶(SalI-HF、NotI -HF)、T4 DNA連接試劑盒、Lipo6000TM轉染試劑、Western一抗稀釋液、HA標簽抗體、Flag標簽抗體、螢火蟲熒光素酶裂解液、雙熒光素酶檢測試劑盒等。

1.1.3 主要設備 全自動高壓滅菌器、微量移液器(2.5、10、100、200、1000 μL)、PCR擴增儀、瓊脂糖凝膠電泳槽、凝膠成像分析系統、離心機、搖床、化學發光儀Amersham Imager 600 System、熒光檢測儀等。

1.2 引物設計

根據GenBank上Rotavirus A NSP1 gene for NSP1, strain: SA11(GenBank: LC178570.1)和Rotavirus A NSP3 gene for NSP3，strain: SA11(GenBank: LC178572.1)基因序列分別設計上下游引物，序列如表1。引物設計時需在其前加入限制性內切酶位點(SalⅠ為上游引物，NotⅠ為下游引物)及保護性堿基，SalⅠ限制性內切酶識別位點前加GTCGAC保護堿基，NotⅠ限制性內切酶識別位點前加GCGGCCGC保護堿基。引物提交生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成[11]。

1.3 PCR擴增

以pUCm-T克隆載體為模版，通過PCR擴增技術進行目的基因片段NSP1和NSP3的擴增，反應體系為100 μL，反應體系如表2。反應程序為：預變性98 ℃ 20 s；變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 5 s，延伸72 ℃30 s，共循環30次；最終延伸72 ℃ 2 min。PCR產物經核酸電泳驗證正確后將條帶切下，用康為膠回收試劑盒進行回收，回收產物與TaKaRa rTaq酶1∶1混合后，72 ℃延伸15 min，使目的基因加上A尾，用康為DNA純化試劑盒純化PCR產物。純化產物用于連接或-20 ℃保存。

表1 Rotavirus A NSP1和NSP3的引物信息

表2 PCR反應體系

1.4 重組質粒的構建及測序鑒定

將加了A尾的NSP1和NSP3片段與TaKaRa 的pMD18-T載體連接，16 ℃連接過夜，連接體系如表3。連接的產物通過熱激法轉化至DH5α感受態菌中37 ℃搖床培養1 h，取適量菌液涂布帶有Amp抗性的LB平板37 ℃培養過夜，挑取單菌落于液體LB培養基(含100 μg/mL Amp)中37 ℃振蕩培養過夜，通過康為質粒小量提取試劑盒提質粒，用SalI和NotI 進行雙酶切37 ℃4 h，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，將大小正確的片段進行膠回收。

表3 連接反應體系

1.5 連接至真核表達載體

酶切產物連接至pRK-Flag/pRK-HA載體。16 ℃連接過夜，連接體系如表4。連接產物通過熱激法轉化DH5α，提取質粒進行雙酶切驗證，驗證正確的重組質粒用康為質粒中提試劑盒提取無內毒素質粒，用于轉染，并送往生工生物公司測序。

表4 連接反應體系

1.6 轉染

以2×105cell/孔HEK293T細胞接種于24孔板，待細胞長至70%～90%時，，將構建成功的質粒進行轉染。用等體積DMEM分別稀釋pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3質粒以及Lipofectamine 6000 1 μL/孔轉染試劑，充分混勻室溫靜置5 min，再將質?；旌衔锱c轉染試劑混合物輕輕混勻室溫靜置20 min，將混合物緩慢滴加至HEK293T中，37 ℃，5% CO2培養箱內培養24 h。

1.7 Western Blot 鑒定蛋白的表達情況

棄去細胞培養基后，用RIPA和2×SDS-PAGE Buffer混合物進行裂解，100 ℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心1 min。取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經SDS-PAGE后將蛋白轉印至NC膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗稀釋液/二抗稀釋液各1 h后，利用化學發光儀Amersham Imager 600 System系統成像分析。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測

HEK293T細胞以2×105個細胞每孔接種于24孔細胞培養板，待其融合度達70%左右按照1.7步驟轉染。分別轉染IFN-β-Luc、ISRE-Luc、和pRL-TK質粒同時轉染pRK-Flag-NSP1和pRK-Flag-NSP3作為實驗組、轉染空載體質粒作為陰性對照、轉染通路上游質粒pRK-Flag-RIG-IN作為陽性對照，每組設置3個重復。轉染24 h后，吸棄細胞培養液，加入100 μL熒光素熒光素酶細胞裂解液，置于震板儀上震蕩10 min，取20 μL上清與螢火蟲熒光素酶底物以及海腎熒光素酶底物按1∶1∶1混勻，利用熒光素酶檢測儀檢測螢火蟲熒光和海參熒光。記錄2次熒光值以及二者比值。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增目的基因

以帶有輪狀病毒SA11株NSP1、NSP3編碼基因的克隆載體為模板進行PCR基因擴增，經瓊脂糖凝膠電泳后得到NSP1和NSP3基因條帶(圖1)，條帶順序依次是2000 DNA marker、NSP1、NSP1、2000 DNA marker、NSP3、NSP3。目的條帶大小在900～1500 bp。經查閱， NCBI中NSP1基因大小約為1491 bp，NSP3基因大小約948 bp，與預期一致，可進行下一步試驗。

圖1 NSP1和NSP3基因PCR擴增結果Fig.1 Result of PCR amplification product of NSP1 and NSP3 gene

2.2 pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3重組質粒的鑒定

對通過Amp抗性篩選的菌落提取質粒，進行雙酶切鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到2條約為1491和948 bp的條帶，符合預期結果見圖2，NSP1和NSP3特異性條帶與預期一致，故可確認NSP1和NSP3基因插入到pRK-Flag/pRK-HA載體中，但重組質粒 pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3能否表達NSP1和NSP3 蛋白仍需進一步驗證。

圖2 pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3重組質粒鑒定Fig.2 The identification of pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1 and pRK-Flag-NSP4/pRK-HA-NSP4 recombinant plasmid

2.3 真核表達載體的表達驗證

將重組質粒轉染HEK293T細胞，轉染24 h后裂解細胞提取蛋白，處理后通過Western Blot，以HA標簽抗體或Flag標簽抗體作為一抗，檢測表達水平，圖3a～d分別為pRK-HA-NSP1、pRK-HA-NSP3、pRK-Flag-NSP1、pRK-Flag-NSP3，結果顯示，表達的NSP1和NSP3蛋白分別為59和37 kDa，可見與預期結果相符，表明目的蛋白表達，可進行下一步試驗。

圖3 Wester blotting 檢測結果Fig.3 The identification result of protein expressed by Western-blotting

2.4 檢測NSP1、NSP3蛋白對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響

為進一步探究NSP1和NSP3蛋白對I型干擾素表達的影響，利用雙熒光素酶報告基因系統，在IFN-I通路上游關鍵信號分子RIG-IN刺激下，檢測NSP1和NSP3蛋白對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響。由圖4顯示，NSP1和NSP3蛋白可抑制由RIG-IN介導的IFN-β和ISRE啟動子活性，證明NSP1和NSP3蛋白對IFN-β信號通路有抑制作用。

圖4 NSP1和NSP3抑制RIG-IN介導的IFN-β和ISRE啟動子活性Fig.4 NSP1 and NSP3 inhibition of the IFN-β and ISRE promoter activities induced by RIG-IN

3 討 論

本研究對合成猿輪狀病毒SA11株的非結構蛋白NSP1和NSP3基因進行PCR，獲得目的基因片段擴增，并在體外構建真核表達載體pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3,成功驗證表達出目的蛋白并獲得其蛋白印跡。后續檢測了NSP1和NSP3蛋白對IFN-β和ISRE啟動子活性的影響，結果顯示，二者均可抑制由RIG-I N介導的IFN-β和ISRE啟動子活性，初步證明了NSP1和NSP3蛋白對IFN-β信號通路有抑制作用。

輪狀病毒是導致嬰幼兒病毒性腹瀉的最重要原因之一，全世界每年約有50萬人死于輪狀病毒。正因為RV具有強突變性，也存在季節性和地域性的問題，導致對RV的醫治僅在改善階段，無法達到清除的效果[1,10]。其中RV NSP1是拮抗宿主先天性免疫的關鍵蛋白，是病毒產生對抗IFN-I的廣譜拮抗劑，從而抑制IFN-I的產生，拮抗先天性免疫[12-13]；NSP3蛋白與病毒粒子感染細胞有關，前人已經研究了病毒蛋白與RNA之間的相互作用，其N端可以與RV mRNA3′保守末端結合，C端與Poly(A)結合引起宿主細胞關閉mRNA的翻譯[3, 14-15]，從而使NSP3在輪狀病毒復制中的起到作用。就目前了解到NSP1蛋白已有對干擾素信號通路的研究報道，本研究結果也符合前人研究的結論，確證了NSP1蛋白拮抗先天免疫的功能。目前NSP3蛋白對IFN-I信號通路的調控機制知之甚少，本試驗對其調控IFN-I信號通路的功能進行初步探究，發現NSP3對RIG介導抗病毒免疫具有明顯的抑制作用。為闡明NSP3蛋白產生抗病毒作用的原理提供理論依據，為后續揭示NSP3蛋白調節IFN-I功能及進一步研究病毒感染后機體抗病毒天然免疫過程具有重要意義。

4 結 論

本研究以PCR技術擴增猿輪狀病毒SA11株NSP1和NSP3的基因序列，將其克隆到pRK真核表達載體中，成功構建重組質粒pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1和pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3，通過Western Blot檢測細胞中存在特異性外源蛋白的表達。本研究發現NSP1和NSP3可以抑制RIG-IN介導的IFN-β及ISRE啟動子活性，為后續探索NSP3蛋白調控IFN-I信號通路具體分子機制提供實驗基礎，為將來抗RV疫苗的開發和有效預防RV感染奠定理論基礎。