不同精粗比日糧對黑藏羊肺組織形態發育、抗氧化酶活性及其mRNA表達的影響

周 力，張峰碩，桂林生，侯生珍

(青海大學農牧學院，西寧 810016)

【研究意義】青海黑藏羊俗稱貴德黑裘皮羊，主要集中分布于青海省海南藏族自治州貴南縣[1]。黑藏羊具有體格較大、體質結實，肌肉發育適中，繁殖性能強，生長速度較快，且肉質細嫩多汁，膻味輕，風味好等特性[2]。最主要的特點為全身被毛及皮膚為純黑色，隨著年齡增大毛色逐漸變成黑紅或灰色[3]。由于早期對該品種保護意識不強，造成種群數量銳減，幾乎瀕臨滅絕。近年來，黑藏羊產業正從生產裘皮向肉用轉型，此時若能了解黑藏羊的品種特性對于調動當地牧民養殖積極性，提高經濟效益具有重要意義。【前人研究進展】肺是氧氣運輸的調控中心，反芻動物通過肺從外界環境攝取氧氣，并且為機體提供所需的氧分子[4]。為了適應高原低氧環境，動物肺部結構會發生明顯的生理變化[5]。目前，許多學者都是圍繞藏系綿羊生長發育[6]、飼養方式[7]、營養需求[8]以及肌肉品質[9]等方面進行了大量研究，但對青海特色資源黑藏羊的研究相對匱乏，關于其肺組織適應低氧環境的遺傳機制更是未見相關報道。【本研究切入點】研究黑藏羊的低氧適應機制對于推動畜牧業的發展具有重要的意義，同時低氧是癌癥等重大疾病產生的重要原因，進行低氧適應原理的研究，也可為高原疾病的治療提供相應思路。【擬解決的關鍵問題】本試驗擬以生活在高寒牧區的黑藏羊為試驗對象，通過研究不同精粗比日糧對育成期黑藏羊肺形態發育、抗氧化酶活性及其相關基因表達的影響，以期為肉羊的飼養管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

飼養試驗于2021年2—6月青海省海南州貴南縣黑藏羊繁育中心進行，試驗期128 d，其中預試期8 d，正試期120 d。

1.2 試驗設計

試驗選擇60只體況良好、體重相近(10.45±0.96)kg的2月齡斷奶黑藏羊，隨機分為3個處理組，每組20只，每組5個重復，每個重復4只。分別飼喂精粗比為70∶30、50∶50和30∶70的日糧。試驗期間每天08:00和17:30將精料與粗料攪拌混勻后飼喂羔羊，粗飼料由燕麥青貯和燕麥青干草組成(以干物質1∶1計)，自由采食和自由飲水。日糧設計參考中國《肉羊飼養標準》(NY/T 816—2004)以及結合當地藏羊飼養實際情況進行飼糧的配制，其日糧組成及營養水平見表1。

表1 日糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 樣品采集與處理

飼養試驗結束后，每組中隨機選取5只黑藏羊于清晨空腹屠宰(禁食12 h、禁水2 h)，然后迅速剪取每只試驗羊右側的肺臟組織兩份，其中一份放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，用于觀察組織形態學，另一份置于液氮中，用于抗氧化酶活性及其相關基因的測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 肺組織形態發育的測定 試驗采用常規石蠟進行包埋，利用蘇木精—伊紅(HE)染色法進行染色。應用電腦Imaginge pro plus 6.0軟件和OlympusBX 51顯微鏡進行觀察和拍照，測量指標包括：肺泡隔厚度、單個肺泡面積、單位面積肺泡數、血管數、血管直徑、中膜厚度以及中膜厚度/血管直徑。每個樣本觀察3張非連續切片，每張切片選取5個視野，每個視野分別測定3組數據，結果取其平均值。

1.4.2 肺組織抗氧化酶活性的測定 從液氮中取肺臟樣品，經過研磨，用生理鹽水稀釋成10%組織勻漿，-20 ℃保存。抗氧化酶活性指標包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，購自江蘇酶標生物科技有限公司。

1.4.3 抗氧化酶相關基因表達的測定 采用Trizol法提取肺組織的總RNA，RNA的濃度和質量通過OD260/280和瓊脂糖凝膠電泳進行。檢測合格后利用北京天根生化科技有限公司提供的FastKing RT kit cDNA的第一鏈合成試劑盒將提取的總RNA進行反轉錄。利用羅氏LightCycler 480實時熒光定量PCR儀測定SOD、CAT和GSH-Px基因的mRNA相對表達量。反應體系為20 μL，其中包括1.0 μL cDNA模板、10 μL 2× SuperReal Color PreMix和正、反游引物各0.6 μL，用RNasc-free ddH2O補足至20 μL。反應條件為∶95 ℃預變性15 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，循環數為40。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參，目的基因的相對表達量采用2-△△CT法[10]計算。引物均由上海生工公司負責合成，引物序列見表2。

表2 引物序列及參數

1.5 數據統計分析

初始數據經過 Excel 2019整理，應用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，試驗結果均以“平均值±標準差”(Mean±SD)表示，以P<0.05作為顯著性判斷的標準。

2 結果與分析

2.1 不同精粗比日糧對黑藏羊肺臟發育的影響

2.1.1 黑藏羊肺組織HE染色結果 采用HE染色法對各組黑藏羊肺組織進行染色，在20×10倍的顯微鏡下觀察，標尺為50 μm，結果如圖1所示。

Ⅰ:肺泡；Ⅱ血管；Ⅲ:中膜；Ⅳ:肺泡隔Ⅰ:Alveolus; Ⅱ:Blood vessels; Ⅲ: Membrane; Ⅳ: Alveolar septum圖1 不同精粗比日糧下黑藏羊肺組織HE染色結果Fig.1 HE staining results of lung tissues of black Tibetan sheep under different diets of concentrate to forage ratio

2.1.2 不同精粗比日糧對黑藏羊肺組織發育的影響 由表3可知，70∶30組和50∶50組肺泡隔厚度顯著高于30∶70組(P<0.05)。50∶50組單個肺泡面積顯著低于30∶70組(P<0.05)，但較70∶30組差異不顯著(P>0.05)。70∶30組和30∶70組單位面積肺泡數顯著低于50∶50組(P<0.05)。

表3 日糧精粗比對黑藏羊肺泡相關測量值的影響

由表4可見，70∶30組血管直徑顯著高于50∶50組和30∶70組(P<0.05)。50∶50組和30∶70組中膜厚度顯著低于70∶30組(P<0.05)。各組間中膜厚度/血管直徑和單位面積血管數差異不顯著(P>0.05)。

表4 日糧精粗比對黑藏羊血管相關測量值的影響

2.2 不同精粗比日糧對黑藏羊肺組織抗氧化酶活性的影響

黑藏羊肺組織抗氧化酶活性結果如表5所示，50∶50組超氧化物歧化酶活性顯著大于70∶30組(P<0.05)，較30∶70組差異不顯著(P>0.05)。70∶30組過氧化氫酶活性顯著小于其他2組(P<0.05)。30∶70組谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于70∶30組(P<0.05)，較50∶50組差異不顯著(P>0.05)。

表5 日糧精粗比對黑藏羊肺組織抗氧化酶活性的影響

2.3 不同精粗比日糧對黑藏羊肺組織抗氧化酶mRNA表達的影響

由圖2可知，50∶50組SOD和CAT基因的mRNA表達量顯著高于70∶30組(P<0.05)，但與30∶70組差異不顯著(P>0.05)。30∶70組GSH-Px基因的mRNA表達量顯著高于70∶30組(P<0.05)，但與50∶50組差異不顯著(P>0.05)。

圖2 黑藏羊肺組織mRNA相對表達量Fig.2 Relative mRNA expression in lung tissue of black Tibetan sheep

3 討 論

3.1 不同精粗比日糧飼糧對黑藏羊肺組織形態發育的影響

在長期的自然選擇與進化過程中，生活在青藏高原及其附近地區的動物，其肺部結構會發生了一系列變化來更好的適應高原低氧環境，并且能夠增加氧氣的攝入、運輸和擴散能力[11]。因此，以“高原黑珍珠”之稱的黑藏羊為試驗對象探討青藏高原土著動物的低氧適應機制具有重要的意義。研究發現，相較于180日齡平原黃牛的肺泡組織結構，180日齡高原牦牛肺泡隔厚度、單個肺泡面積和單位面積內肺泡數之間差異均不明顯，但單位面積內肺泡面積顯著增大，有利于高原牦牛在低氧環境下的氣體交換[12]。馮秋菊等[13]同樣指出，與平原同類動物相比，高原土著動物更有利于低氧環境下的氣體交換，其原因與體內單位面積內的肺泡數較多和肺泡隔較厚有關。此外，賈榮莉[14]試驗也證實，藏羊肺組織中肺泡較小，單位面積肺泡數量多，單位面積血管數量較多，有助于藏羊增加肺部氧氣的攝入和轉運。基于上述人員研究結果可以看出，反芻動物肺臟發育狀況與其機體適應高原低氧的環境具有緊密的聯系。在本試驗中，相較于70∶30組與30∶70組，50∶50組黑藏羊肺組織發育較佳。其原因可能是日糧中的適宜精料水平能夠促進瘤胃發酵。增加對營養物質的消化吸收，但精料添加過高，也會使瘤胃產酸增加，繼而影響機體正常的生長發育。

3.2 不同精粗比日糧對黑藏羊肺組織抗氧化酶活性的影響

當體內抗氧化能力降低時，會造成活性氧自由基數量急劇上升，發生氧化還原反應，引起氧化損傷與細胞功能失調，從而影響機體健康[15]。而SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶能夠清除有害的氧自由基，以達到保護的目的[16]。其中，SOD作為生物體內氧自由基的天然清除劑，其活性能夠反映機體清除氧自由基的能力[17]。CAT可以特異性清除體內過多的過氧化氫，保護細胞免受過氧化損傷[18]。而GSH-Px是分解體內過氧化物的重要分子，消除細胞內的過氧化氫及脂質自由基，有利于維持細胞膜結構的完整[19]。以貴州黑山羊為研究對象，發現日糧精料水平由22%提高至66%時，可以提高血漿中T-AOC、SOD、GSH-Px水平，并且能夠降低MDA含量，其抗氧化應激能力持續增強[20]。Sgorlon等[21]指出，當飼糧中精料水平由30%增長到55%時，母羊血液抗氧化應激能力持續增加。侯志高等[22]在荷斯坦奶牛上也得到類似的結論。以上研究均證實營養物質的缺乏和不平衡均不能滿足反芻動物營養需要，甚至導致體內自由基數量不斷蓄積，從而擾亂氧化應激的平衡狀態，發生氧化應激反應。從本試驗來看，當日糧精粗比為50∶50時，能夠提高肺組織中SOD、CAT和GSH-Px活性。可能是由于適宜的營養水平日糧在一定程度上使體內自由基的產生和消除處于可調控范圍，平衡氧化應激狀態，從而提高黑藏羊抗氧化應激的能力。此外，本試驗也發現，日糧精粗比與黑藏羊肺組織的SOD、CAT和GSH-Px基因的mRNA表達量存在密切的聯系，其機理有待接下來深入的研究。

4 結 論

在本試驗條件下，適宜的精粗比日糧有利于促進黑藏羊肺組織形態發育，并增強其抗氧化能力，其中精粗比為50∶50的日糧飼喂效果較佳。