煙草NtNRAMP3.1基因克隆、表達及Cd轉運特性分析

陳邦蘭，龍 濤，高永峰，黃仁華,2，劉繼愷, 2, 3

(1.西南科技大學生命科學與工程學院, 四川 綿陽 621010; 2. 西南科技大學核廢物與環境安全國防重點實驗室, 四川 綿陽 621010；3. 核廢物與環境安全省部共建協同創新中心, 四川 綿陽 621010)

【研究意義】鎘(Cd)位于元素周期表第五周期ⅡB族，價電子構型4d105S2，主要為+2價和0價。單質Cd本身無毒，但其化合物存在毒性及腐蝕性，在植物中會產生累積性毒害[1-2]。煙草屬于Cd易富集植物，其吸收的Cd主要積累于根、葉中[3]。Cd不僅會抑制煙草的生長發育、影響煙葉品質，還對吸煙者的健康構成潛在的威脅[4]。因此，對相關基因進行克隆和功能鑒定對于闡明煙草Cd吸收積累的分子機制，以及利用基因工程手段提高煙葉品質顯得十分必要。雖然NRAMP基因已在多個植物物種中被鑒定，但有關煙草NRAMP基因的研究還很缺乏。NtNRAMP5是目前唯一被克隆的煙草NRAMP基因，其編碼的蛋白定位于質膜，具轉運有Mn和Cd的能力[5]。【前人研究進展】過量的Cd會抑制植物的生長發育，多數表現為植株矮小、葉片失綠、生長緩慢、生物量下降等。且隨著Cd濃度的升高，植物葉片內的葉綠素含量和葉綠素a/b的比值均呈現出下降趨勢[6]。同時，Cd可使線粒體的膜結構發生變化，內部結構喪失，影響內膜上的氧化磷酸化，從而抑制小麥的呼吸作用[7]。此外，Cd還會影響植物根部細胞水和營養物質的吸收，干擾鈣(Ca)、鎂(Mg)、鉀(K)和磷(P)的吸附[8]。丙二醛(MDA)是植物在逆境條件下發生膜脂過氧化作用的產物。研究發現，隨著Cd2+處理濃度的升高，桉樹[9]、火炬樹[10]中MDA的含量也逐漸上升，導致膜脂過氧化加劇，說明Cd會使植物產生氧化逆境。Cd進入植物的途徑很多，主要經皮層組織進入植物根部，再通過質外體或共質體到達木質部，進而運輸到植物其他部位[11]。金屬轉運蛋白是一類膜定位蛋白，在金屬離子吸收與轉運過程中扮演著重要角色。目前人們已鑒定到多個參與Cd運輸的金屬轉運蛋白，如P1B-ATPase家族的TaHMA2[12]，CDF家族的MTP1[10]和ZIP家族的AtIRT1、OsIRT1、OsIRT2和Tcirt1-G等[13-16]。自然抗性相關巨噬細胞蛋白(Natural resistance associated macrophage proteins，NRAMPs)是一類參與金屬離子運輸的跨膜轉運蛋白，首先在動物中被發現且廣泛存在于植物中。NRAMP蛋白不僅在Mn、Zn和Fe等微量元素的吸收分配中發揮作用，還參與了植物對Cd等毒性重金屬的吸收和轉運[17]。例如，在擬南芥中，AtNRAMP6定位于側根和幼嫩葉片細胞的高爾基體或反面高爾基網絡上，是Cd和Fe的轉運蛋白[18-19]。在水稻NRAMP基因家族中，OsNRAMP1定位于質膜，負責Cd和Mn等金屬離子的吸收和轉運[20-21]。OsNRAMP5定位于質膜，是Mn和Cd的主效轉運蛋白[22]。OsNRAMP6定位于質膜，在酵母實驗中被證明具有Cd轉運功能[23]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究前期通過生物信息學的方法發現煙草基因組中存在9個NtNRAMP基因，本研究對其中一個成員NtNRAMP3.1基因進行了克隆并分析了其組織表達和對不同重金屬的應答模式，同時通過將其在酵母細胞中異源表達，對其Cd轉運能力進行了鑒定?！緮M解決的關鍵問題】本研究結果將為深入了解煙草NtNRAMP基因家族在植物金屬離子吸收轉運中的功能，以及利用現代生物技術培育Cd低積累的煙草品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與脅迫處理

供試植物材料煙草‘K326’由四川省農業科學院經濟作物研究所提供。酵母菌株BY4741購自Euroscarf網站(http://www.euroscarf.de)。

將經10% NaClO清洗的無菌煙草種子分別播種于以下幾種固體培養基上垂直培養：1/2 MS(對照)；不含MnSO4的1/2 MS(缺Mn)；1/2 MS + 500 μmol/L MnSO4(過量Mn)；不含ZnSO4的1/2 MS(缺Zn)；1/2 MS + 100 μmol/L ZnSO4(過量Zn)；不含FeSO4的1/2 MS(缺Fe)；1/2 MS + 500 μmol/L FeSO4(過量Fe)；1/2 MS + 50 μmol/L CdCl2(Cd處理)。培養1個月后分別對煙草幼苗的葉和根進行取樣，樣品經液氮速凍后置于-70 ℃儲存備用。

1.2 生物信息學分析

利用ClustalW軟件對擬南芥和水稻的自然抗性相關巨噬細胞蛋白(Natural resistance associated macrophage protein，NRAMP)與NtNRAMP3.1的氨基酸序列進行比對。使用MEGA 6.0軟件中的最大釋然法并基于1000次重復抽樣檢驗構建NtNRAMP3.1和其他NRAMP蛋白的進化樹[24]。

利用TMHMM Server V.2.0預測NtNRAMP3.1蛋白的跨膜結構域(Transmembrane domians，TMs)，并使用TMRPres2D展現其拓撲結構[25]。

1.3 煙草NtNRAMP3.1基因的表達模式分析

總RNA的提取和反轉錄參見Liu等[26]的方法。以NtL25(基因編號：L18908.1) 和Ntubc2(基因編號：AB026056.1)作為內參基因，采用TransStart Green qPCR SuperMix在Bio-Rad公司的CFX96 Real-time System進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR),使用的基因特異引物見表1。

表1 使用的引物及其序列

1.4 煙草NtNRAMP3.1基因的克隆及其酵母表達載體的構建

根據SGN網站(https://solgenomics.net/)的NtNRAMP3.1基因(基因編號：nitab4.5_0002568g0010.1)序列，設計帶有KpnI和EcoR I雙酶切位點的特異性引物NtNRAMP3.1-F和NtNRAMP3.1-R(引物序列見表1)。以煙草幼苗cDNA為模板進行PCR擴增。PCR程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環;72 ℃延伸5 min。將擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用TIANGEN公司的通用型DNA純化回收試劑盒對目的條帶進行回收。通過酶切連接的方法將目的片段插入到pYES2載體的KpnI和EcoR I位點，并將連接產物轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞，陽性克隆送華大基因科技股份有限公司測序。

1.5 酵母轉化及表型分析

1.5.1 酵母轉化 利用PEG/LiAC酵母轉化法分別將pYES2和pYES2+NtNRAMP3.1質粒轉入酵母菌株BY4741中[27]。將轉化后的酵母涂布于SD/-ura(Dex)固體培養基上，置于30 ℃培養3～4 d。

1.5.2 點板分析 挑取酵母單克隆到SD/-ura (Dex)液體培養基，于30 ℃，200 r/min培養2 d。酵母菌經4000 r/min，離心5 min后，倒掉上層培養基，用無菌去離子水重懸菌體使菌液的OD600=0.2。依次將酵母菌液稀釋成5個梯度，每個梯度稀釋10倍。最后各取2 μL點板，置于30 ℃，培養2～4 d并拍照記錄。使用的對照組培養基為SD/-ura(Dex)，實驗組為SD/-ura(Gal+Raff)+ 40/60 μmol/L CdCl2。

1.5.3 生長曲線測定 分別將含有pYES2和pYES2+NtNRAMP3.1的酵母菌加入20 mL液體培養基中，使其OD600在0.05左右。將酵母菌置于30 ℃，200 r/min培養，分別在0、2、5、10、12、24、28、32、36、48、54、60 h測定菌液的OD600。使用的對照組培養基為SD/-ura(Dex)，實驗組為SD/-ura(Gal+Raff)+ 60 μmol/L CdCl2。

1.5.4 Cd含量的測定 首先將轉基因酵母菌接種于SD/-ura(Gal+Raff)液體培養基中培養9 h左右，使其OD600在0.1左右。然后向培養液中加入CdCl2使Cd2+的終濃度為20 μmol/L。酵母菌在30 ℃，200 r/min培養24 h后離心收集菌體。收集的菌體先用100 μmol/L 的EDTA洗1遍，再用無菌去離子水洗3遍，最后置于70 ℃烘干至恒重。

將干燥后的菌體稱重后，分別加入4 mL的HNO3并置于180 ℃消解。利用原子吸收光譜儀(AA700, 美國PE公司)測定樣品中Cd含量。

2 結果與分析

2.1 煙草NtNRAMP3.1基因的克隆及序列分析

以煙草cDNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增，獲得與預期條帶大小一致的擴增條帶(圖1)。測序結果顯示，擴增得到的核酸片段序列與預期序列(nitab4.5_0002568g0010.1)一致，由此NtNRAMP3.1基因克隆成功。序列分析表明，NtNRAMP3.1基因全長1542 bp，編碼一個大小為513個氨基酸，具有11個跨膜結構域的蛋白，該蛋白的N端和C端分別位于胞外和胞質內(圖2)。通過構建煙草NtNRAMP3.1與擬南芥和水稻NRAMP蛋白的進化樹發現，煙草NtNRAMP3.1屬于NRAMP家族的第一亞組，與擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP4的親緣關系最近(圖3)。氨基酸序列比對(圖4)顯示，除了OsNRAMP8，其余第一亞組成員均含有NRAMP家族的保守結構域CTM(Consensus Transport Motif)，但在個別位點存在差異，其中NtNRAMP3.1在CTM最后一位的氨基酸為組氨酸(H)，其余成員的為天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)。

M: Trans2K Plus II DNA maker; 1: NtNRAMP3.1圖1 煙草NtNRAMP3.1基因PCR擴增電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification product of NtNRAMP3.1 gene from tobacco

圖2 NtNRAMP3.1蛋白的跨膜結構Fig.2 Transmembrane structure of NtNRAMP3.1

圖3 煙草NtNRAMP3.1基因系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of NtNRAMP3.1 gene

黑色直線表示CTM結構域；相應基因的登錄號：OsNramp1 (Os07g15460), OsNramp2 (Os03g11010), OsNramp3 (Os06g46310), OsNramp4 (Os02g03900), OsNramp5 (Os07g15370), OsNramp6 (Os01g31870), OsNramp7 (Os12g39180), OsNramp8 (Os03g41070), AtNramp1 (At1g80830), AtNramp2 (At1g47240), AtNramp3 (At2g23150), AtNramp4 (At5g67330), AtNramp5 (At4g18790), AtNramp6 (Atlg15960)Black line denotes the CTM motif；Accession numbers for the corresponding genes are OsNramp1 (Os07g15460), OsNramp2 (Os03g11010), OsNramp3 (Os06g46310), OsNramp4 (Os02g03900), OsNramp5 (Os07g15370), OsNramp6 (Os01g31870), OsNramp7 (Os12g39180), OsNramp8 (Os03g41070), AtNramp1 (At1g80830), AtNramp2 (At1g47240), AtNramp3 (At2g23150), AtNramp4 (At5g67330), AtNramp5 (At4g18790), AtNramp6 (Atlg15960)續圖4Continued fig.4

2.2 煙草NtNRAMP3.1基因對不同重金屬脅迫的應答模式

用不同重金屬離子處理煙草植株，通過對NtNRAMP3.1基因在根、葉組織中的表達情況進行qRT-PCR分析(圖5)發現，在正常生長和重金屬脅迫處理的煙草幼苗中，NtNRAMP3.1基因在葉中的表達量均高于根，但是其對不同重金屬脅迫表現出不同的應答模式。在煙草的根中，Cd、過量Mn和缺Fe處理組的NtNRAMP3.1基因相對表達量高于對照組，其中Cd處理的相對表達量最高，是對照組表達量的3.19倍，而其余處理(缺Mn、缺Zn、過量Zn和Fe)則顯著抑制NtNRAMP3.1基因的表達。在煙草的葉中，除Fe處理組(過量Fe和缺Fe)外，其余處理中NtNRAMP3.1基因的表達量均高于對照組，其中過量Mn處理中相對表達量最高，為對照組的2.05倍。統計分析表明，除Zn處理組(過量Zn和缺Zn)外，其余各處理組中NtNRAMP3.1基因的表達量與對照組均存在極顯著性差異。

用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，*表示同一組織處理組與對照的顯著性差異(P<0.05)，**表示同一組織處理組與對照的極顯著性差異(P<0.01)Independent sample t test is used for significance analysis. The mark * represents the significant difference (P<0.05) between heavy metal treatment groups and control on each tissue. The mark ** represents the highly significant difference (P < 0.01) between heavy metal treatment groups and control on each tissue圖5 NtNRAMP3.1基因在不同重金屬處理下的表達Fig.5 Expression pattern of NtNRAMP3.1 gene under different heavy metal treatments

2.3 煙草NtNRAMP3.1的表達增強了酵母對Cd的敏感性

利用酵母點板的方法研究了轉基因酵母菌在含有不同濃度CdCl2培養基上的生長情況。結果(圖6)顯示，含有空載體和目的基因的酵母菌在不含CdCl2的培養基(對照)上的生長情況基本一致，CdCl2處理均可以抑制酵母菌的生長，但是對含有NtNRAMP3.1的酵母菌的抑制作用更為顯著，其在含有60 μmol/L CdCl2的培養基上幾乎不能生長。為了進一步研究NtNRAMP3.1對酵母Cd敏感性的影響，在不同時間點分別測定了轉空載或NtNRAMP3.1的酵母菌在不含和含有60 μmol/L CdCl2的液體培養基中的OD600值，并繪制生長曲線，得到的結果和點板實驗的一致。從第2小時開始，CdCl2處理顯著抑制了酵母菌的生長(圖7)，在第12小時，含有空載體和目的基因的酵母菌生長情況出現差異，到第24小時，Cd對含有NtNRAMP3.1基因的酵母菌的抑制作用與含有空載的酵母相比變得極顯著。上述結果表明煙草NtNRAMP3.1基因的表達增強了酵母對Cd的敏感性。

圖6 轉基因酵母的生長情況Fig.6 The growth of transgenic yeast

2.4 煙草NtNRAMP3.1對酵母Cd吸收的影響

為了探究NtNRAMP3.1基因增強酵母對Cd的敏感性的原因，分別測定了20 μmol/L Cd處理24 h后，轉空載和NtNRAMP3.1基因酵母中的Cd含量(圖8)，轉NtNRAMP3.1基因酵母中Cd的濃度明顯高于轉空載的酵母，t檢驗顯示兩者的Cd濃度存在極顯著性差異，表明煙草NtNRAMP3.1基因增強了酵母對Cd的吸收能力。

圖7 生長曲線Fig.7 Growth curve

用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，**表示對照與轉NtNRAMP3.1基因酵母中Cd積累量的極顯著性差異(P<0.01)Independent sample t test is used for significance analysis.The mark ** represents the highly significant difference (P<0.01) of Cd accumulation between control and NtNRAMP3.1 transgenic yeast圖8 酵母對Cd的吸收Fig.8 Cd uptake in yeast

3 討 論

雖然NRAMP基因家族已在多個植物物種里被鑒定和功能研究，但是關于煙草NRAMP基因的研究還很少，目前僅初步探究了NtNRAMP5的亞細胞定位和重金屬轉運底物。本研究通過對克隆到的NtNRAMP3.1基因進行生物信息學分析發現，雖然煙草NtNRAMP3.1基因具有NRAMP家族的典型特征[28]，但其編碼蛋白的CTM結構域的最后一位氨基酸與其他擬南芥和水稻NRAMP第一亞家族成員的具有差異(NtNRAMP3.1是H，其余的為N或D)。之前的研究發現擬南芥AtNRAMP4第413位的苯丙氨酸突變為異亮氨酸(F413I)會影響其轉運Cd的能力，序列分析發現這一位點正好在一個保守基序內[29]。CTM是NRAMP蛋白家族的保守結構域，可能參與了與ATP耦合亞基的相互作用[17]，因此，上述最后一個氨基酸的差異是否影響煙草NtNRAMP3.1蛋白的金屬轉運能力還有待進一步研究。

進化分析結果表明，煙草NtNRAMP3.1蛋白屬于NRAMP家族的第一亞家族，和擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP4的親緣關系最近。擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP4是定位于液泡膜的Cd、Fe和Mn的轉運蛋白[30]。在種子萌發過程中，這2個蛋白可將液泡中的Fe向外轉運利用；在成年植株中，它們可將Mn從液泡中轉運到光合組織參與光合作用[31-32]。本研究發現NtNRAMP3.1可以將胞外的Cd轉運到胞內，但其是否具有轉運Fe和Mn的功能還有待進一步探究。另外，GUS活性分析顯示Fe缺乏可同時顯著提高地上和地下部中AtNRAMP3和AtNRAMP4基因啟動子的活性[31, 33]。本研究發現缺Fe處理可顯著提高NtNRAMP3.1基因在根中的表達，但抑制了其在地上部分表達；過量的Fe處理可同時抑止NtNRAMP3.1基因在地上和地下部的表達。可見，在轉錄水平上，NtNRAMP3.1基因對Fe的響應與AtNRAMP3和AtNRAMP4具有一定差異。此外，NtNRAMP3.1基因的表達還受到Mn處理的調控，雖然其內在機制目前還不清楚。

將目的基因轉化到野生型或突變體酵母中并進行表型觀察是快速鑒定重金屬轉運蛋白金屬底物的有效方法。本研究利用該方法發現煙草NtNRAMP3.1蛋白是Cd的轉運蛋白，異源表達NtNRAMP3.1基因可增強酵母對Cd的敏感性。水稻OsNRAMP1被證明是Cd的轉運蛋白，經Cd處理的轉OsNRAMP1基因的酵母中的Cd含量是對照細胞中的1.4倍[34]。為了進一步探究煙草NtNRAMP3.1蛋白增強酵母Cd敏感性的原因，我們檢測了酵母細胞中Cd的含量，發現含有煙草NtNRAMP3.1的酵母細胞中Cd積累量顯著高于對照組，暗示煙草NtNRAMP3.1是在Cd的流入(influx)而非流出(efflux)中發揮作用。此外，我們還發現Cd處理可顯著增加NtNRAMP3.1基因在煙草地上和地下部的表達。這些結果暗示煙草NtNRAMP3.1可能在煙草Cd吸收轉運中具有重要功能。

4 結 論

本研究從煙草中克隆到了NRAMP的同源基因NtNRAMP3.1，該基因具有NRAMP基因家族的典型結構。NtNRAMP3.1基因的表達具有組織特異性，且受Cd誘導；在酵母中異源表達NtNRAMP3.1可增加酵母對Cd的敏感性，這些結果暗示NtNRAMP3.1是Cd的轉運蛋白。此外，NtNRAMP3.1基因的表達還受到Mn、Zn和Fe的調控，但其中的分子機制目前還不清楚，有待進一步探索。本研究結果可為深入了解煙草NtNRAMP基因家族在金屬離子吸收轉運中的功能，以及利用現代生物技術培育Cd低積累的煙草品種提供理論依據。