硝酸鈰亞慢性暴露對大鼠神經行為功能的影響

劉健新，馬宇鴻，郝衛東

(北京大學公共衛生學院毒理學系，食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191)

稀土元素因為其獨特的理化性質，被廣泛應用于農業、石油化工、畜牧業、高新技術產業等行業。稀土農用可提高農作物的發芽率和存活率，提高果樹的坐果率，還可促進動物生長，提高經濟收益[1-3]。越來越多的稀土元素進入日常生活，并通過生物積累進入食物鏈，目前稀土膳食暴露是人群稀土暴露的主要途徑。2007年第4次中國總膳食研究調查顯示谷薯、瓜果、肉類、水產等12類膳食樣品均含有較高的鑭(La)、鈰(Ce)等輕稀土元素[4]，江西省某地茶葉中各稀土元素檢出率均超過97%，超標率為49.6%，其中鈰元素含量高于其他稀土元素，達到0.85 mg/kg[5]。

鈰是含量最豐富的稀土元素，在地球上的儲量為0.004 6%，其質地較軟，具有延展性，化學性質較活潑，在自然界中多以氧化態的形式存在，且與其他稀土氧化物共同存在于同一礦物中，難分離[6]。鈰及其化合物因具有不同的特性還有一些特殊的用途，如納米氧化鈰因具有再生抗氧化活性和抗脂肪變性，在預防及治療結直腸癌及肝細胞癌等腫瘤方面具有重要意義[7-8]；硫化鈰比傳統的無機染料顏色鮮艷且耐溫性高[6]；添加劑硝酸鈰能夠提高化學鍍Ni-W-P鍍層的耐腐蝕性和耐磨性等[9]。一般情況下，小劑量短期接觸稀土元素不會對人體健康產生明顯危害，甚至具有特殊藥效和保健作用，如氯化鑭可被用于預防動脈粥樣硬化，硝酸鈰可以作為燒傷、燙傷等創面的消毒劑[10]。但人群流行病學調查顯示，長期低劑量暴露稀土元素可降低稀土礦區嬰幼兒的運動能力和兒童智力[11-12]。稀土礦區居民血液、頭發和尿液中稀土元素均高于非礦區，其中鈰含量高于其它稀土元素[13]。但目前單一稀土元素鈰對神經行為影響的毒理學資料尚不夠完善。

農用稀土化合物以及酸性土壤或水源可使稀土元素以離子形式存在，繼而富集于動植物體內。故本次實驗采用硝酸鈰灌胃染毒，參照經濟合作與發展組織(organization for Economic Cooperation and Development，OECD)GD-424推薦的嚙齒動物神經行為毒性評價方法進行，觀察硝酸鈰亞慢性(90 d)暴露后大鼠行為學的改變，從情緒、學習記憶和運動平衡協調能力方面評估硝酸鈰對大鼠神經行為的影響，旨在為稀土元素鈰的風險評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 受試物及主要實驗儀器

硝酸鈰(Ⅲ)六水合物[Cerium(Ⅲ)nitrate hexahydrate，Ce(NO3)3·6H2O]，純度＞99%，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司。硝酸鈰溶液配制：稱取66.55 g硝酸鈰六水合物，溶于1 L ddH2O中，即為50 mg/mL硝酸鈰染毒儲備液，用ddH2O將儲備液進行相應稀釋得到10、2 mg/mL硝酸鈰染毒液。大鼠每100 g體質量給予1 mL染毒液。

本實驗主要儀器包括：大鼠轉棒儀(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)，大鼠曠場儀和大鼠高架十字迷宮(上海吉量科技有限公司)，大鼠Morris水迷宮(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)，ANY-maze動物行為學采集和分析系統(美國Stoelting有限公司)，Elan DRCⅡ型電感耦合等離子體質譜儀(美國Perkin-Elmer Sciex公司)，微波消解系統(意大利Milestone公司)。

1.2 實驗動物處理

選擇初斷乳，即新生21 d(PND21)無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級SD大鼠，體質量45～60 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。大鼠適應性喂養5 d后編號，按照體質量大小排序后，采用隨機數字表法分為4組，分別為正常對照組(ddH2O)，Ce(NO3)3低劑量組(20 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)和高劑量組(500 mg/kg)，每組雌、雄鼠各12只。劑量設計參考國家食品安全風險評估中心提供的硝酸鈰的大鼠半數致死劑量(lethal dose 50，LD50)和未見毒性反應劑量(no observed adverse effect level，NOAEL)[14]。高劑量約為1/6 LD50，中劑量參考硝酸鈰的NOALE值[75 mg/(kg·d)]。連續灌胃90 d后，進行行為學測試，且行為學測試期間持續暴露硝酸鈰。動物飼養于北京大學公共衛生學院IVC動物飼養系統，相對濕度40%～70%，溫度22～25℃。光照條件為12 h/12 h晝夜周期模式，大鼠自由攝食與飲水。動物實驗符合北京大學動物福利與實驗動物管理委員會相關規定，并通過動物實驗倫理審查(LA2019053)。

1.3 曠場實驗

曠場實驗箱體為底壁分離，無頂蓋的箱體。將5塊ABS黑色塑料板圍成的體積為100 cm×100 cm×50 cm的曠場裝置放置于隔音房間，弱光照明。實驗開始前2 h，將動物放入該房間適應環境。實驗者每次于同一位置將動物放于實驗箱中央位置，動物頭部朝向同一個方向，實驗人員離開實驗裝置區域后開始實驗。曠場實驗箱底部被分若干網格，動物在該區域自由探索5 min，記錄如下活動參數：水平運動距離、中央區停留時間、進入中央區次數。動物在中央區的活動情況反映其焦慮程度，即焦慮動物中央區活動次數較少。

1.4 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮是由兩個閉合壁(50 cm×10 cm)、兩個開放壁(50 cm×10 cm)和中央區(10 cm×10 cm)構成的垂直十字，距離地面高50 cm，各個壁均由黑色塑料構成。實驗開始前2 h，將動物放入隔音房間以適應環境。嚴格控制房間溫度和通風。實驗者每次于同一位置將動物放于中央區位置，動物頭部朝向其中一個開放壁的方向，實驗人員離開實驗裝置區域后開始實驗。實驗時間5 min，以動物在開臂內停留時間和進入開臂次數占總次數和總時間的百分比為主要指標評價動物焦慮情況。每只動物只測試1次，如果在實驗過程中動物掉落，則剔除該數據。

1.5 轉棒實驗

大鼠轉棒儀共6個通道，各個通道共用質地粗糙的轉棒。實驗開始前將動物放于速度為4 r/min的轉棒上適應轉棒環境1 min，直到動物不掉落。動物在適應環境后放入轉棒儀，動物頭部朝向同一方向，正式實驗采用勻加速方式，實驗時間為300 s，轉速從4 r/min加速到40 r/min。記錄動物在棒時間，重復測量3次，取平均值。

1.6 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮裝置放置于水迷宮專用房間內，嚴格控制房間溫度和光照。該裝置為直徑150 cm，高50 cm的圓形水池，池壁和底部均為黑色。水池壁上貼有正方形、長方形等白色貼紙作為動物視覺線索。水池內水深22～23 cm，恒溫裝置保證水溫始終在(23±2)℃。圓形水池均分為4個象限，任選其中一個象限放入直徑為12 cm的黑色平臺，位于水平面下1～2 cm。實驗包括：①定位航向實驗。分別以各象限的統一位置作為起始點，動物面朝池壁，從任一象限起始點輕輕放入水池中。一個象限一次實驗時間為90 s，從動物入水至四肢爬上平臺的時間作為逃避潛伏期。動物爬上平臺后，讓其停留30 s。若在90 s內動物未找到平臺，則潛伏期記為90 s，并人為引導其找到平臺，并停留30 s。每天每只動物訓練4次，連續訓練4 d。②空間探索實驗。定位航行實驗結束的24 h后，移除平臺。將動物面向池壁，從任一象限輕輕放入水中，記錄動物在2 min內游泳速度、游泳距離、進入目標象限次數和跨越原平臺次數。

1.7 海馬組織中Ce元素含量的檢測

行為學實驗結束后，采用腹主動脈取血法處死動物，斷頭取腦。冰上分離雙側海馬。然后取0.03 g海馬組織于8 mL的石英消解管中，加入0.5 mL濃硝酸，靜置2 h后，加壓40 bar(氮氣)進行微波消解：室溫-150℃、5 min；150～190℃、5 min；190℃、20 min；功率1 200 W。消解完畢后加入內標銦(2 ng/mL)0.4 mL，定容至8 mL，搖勻后，采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS)測定Ce元素。

儀器條件如下：霧化器流量，1.05 L/min；輔助氣流量，1.80 L/min；等離子體氣流量，1.85 L/min；射頻發生器功率，1 180 W；駐留時間，50～100 ms；樣品提升量，1.1 mL/min；掃描方式，單點跳峰；分辨率，0.7～0.9 amu。

質控樣GBW09101a標樣分析結果：為了考核本法的準確性，選用GBW09101人發樣進行驗證試驗，測定結果鈰元素為(20.23±0.25)ng/g，參考值為(19.7±2.6)ng/g；相對標準偏差為1.5%。實驗結果表明，人發標樣GBW09101中鈰的測定值與參考值吻合，證明本法準確可靠。

1.8 腦組織病理學檢查

行為學實驗結束后，每組隨機取雌、雄SD大鼠各5只，腹主動脈取血后，斷頭取腦。腦組織固定于4%多聚甲醛溶液3～5 d。經脫水、透明、浸蠟及包埋處理后，連續冠狀切面切取厚度為4μm的石蠟切片。展片、烘片和烤片后，HE染色，光學顯微鏡下對腦組織進行病理學檢查。

1.9 統計學分析

應用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析。對于Morris水迷宮、定位航向實驗的指標采用雙因素重復測量方差分析；其他各組指標，采用單因素方差分析，實驗組與對照組間的兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。統計學檢驗水平為α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠一般情況和染毒后腦組織中Ce元素的含量

硝酸鈰染毒90 d大鼠體質量變化結果和腦組織中Ce元素的含量見表1。高劑量組500 mg/(kg·d)雄性大鼠與對照組相比，體質量出現明顯下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)。雌、雄大鼠各組血生化及血象指標未見明顯異常(結果未顯示)。與對照組相比，雌、雄SD大鼠硝酸鈰染毒后腦組織中鈰元素含量差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表1 硝酸鈰染毒對大鼠體質量和腦組織中Ce元素含量的影響

2.2 曠場實驗、高架十字迷宮實驗和轉棒實驗結果

大鼠暴露硝酸鈰90 d后，曠場實驗結果顯示，與對照組相比，低、中、高硝酸鈰劑量組大鼠的水平運動距離、進入中央區次數和中央區停留時間的差異均無統計學意義(P＞0.05，表2)；高架十字迷宮結果顯示，與對照組相比，各硝酸鈰劑量組雌雄大鼠進入開臂時間百分比和進入開臂次數百分比差異均無統計學意義(P＞0.05，表3)。

表2 硝酸鈰90 d暴露雌性大鼠曠場實驗、高架十字迷宮實驗和轉棒實驗結果(n=12)

表3 硝酸鈰90 d暴露雄性大鼠曠場實驗、高架十字迷宮實驗和轉棒實驗結果(n=12)

2.3 Morris水迷宮實驗結果

硝酸鈰90 d暴露后雌雄SD大鼠定位航向實驗結果如圖1所示，隨著訓練天數增加，各組大鼠平臺學習時間減少。但在訓練4 d中，與對照組相比，各硝酸鈰暴露組雌、雄大鼠的逃避期差異均無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 硝酸鈰90 d暴露對大鼠定位航向的影響(n=12)

雌雄SD大鼠空間探索實驗結果如表4和表5所示，各組雌雄大鼠游泳總距離、游泳速度、進入目標象限次數、目標象限游泳時間和穿越平臺位置次數與對照組間的差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表4 硝酸鈰90 d暴露雌性大鼠水迷宮實驗結果(n=12)

表5 硝酸鈰90 d暴露雄性大鼠水迷宮實驗結果(n=12)

2.4 大鼠海馬組織病理學檢查結果

硝酸鈰亞慢性暴露90 d對大鼠海馬組織CA1區和DG區的影響如圖2和圖3所示。在光學顯微鏡下，與對照組相比，各硝酸鈰劑量組雌雄大鼠海馬組織CA1區神經元數量正常，呈圓形或橢圓形，核仁清晰，著色均勻；DG區顆粒細胞邊界清晰，組織分界明顯，神經元細胞形態完整，數量無明顯差異，細胞核未見異常。此結果表明亞慢性硝酸鈰暴露未顯示對雌雄大鼠海馬組織結構產生病理性改變。

圖2 硝酸鈰90 d暴露對大鼠海馬組織CA1區的影響(×400)

圖3 硝酸鈰90 d暴露對大鼠海馬組織DG區的影響(×400)

3 討論

作為重要的戰略資源，稀土需求量逐年增加[15]。鈰在眾稀土元素中豐度最高，由于其良好的生物活性和獨特的理化性質，被應用于多個領域[16]。已有研究證明，鑭、釤和釔能夠透過血腦屏障，對動物的學習記憶能力產生損害作用[17-19]，圍產期釓暴露能夠導致子代小鼠焦慮樣行為及運動障礙[20]。但對于鈰元素對神經行為影響的報道尚不完善。主要存在以下不足：①既往關于神經毒性的研究以鑭元素為主，對鈰及其化合物相關性研究較少；②稀土元素神經毒性的資料集中于早期，而早期評價方法技術有限。本次研究從情緒、運動能力和學習記憶能力方面對鈰元素進行評價，以期為制定鈰元素健康指導值提供依據。

曠場實驗和高架十字迷宮實驗是基于嚙齒動物回避開放或高架場所的天性和對新環境的探索而構建的動物癥狀模型，理論上，焦慮的動物具有趨觸性，具體表現為重復無目的沿著曠場箱壁運動和較長時間停留在閉臂空間，作為溫和、不刺激的實驗方法，被廣泛用于測試藥物等因素對焦慮情緒的影響[21-22]。本研究結果顯示在曠場實驗和高架十字迷宮實驗中，與對照組相比，硝酸鈰暴露組雌雄大鼠進入中央區次數、中央區停留時間、開臂次數百分比和開臂時間百分比差異均無統計學意義，表明經口暴露硝酸稀土可能不會引起SD大鼠焦慮。曠場實驗和轉棒實驗也用于評價硝酸鈰長期暴露對大鼠運動能力的影響。兩者分別用于評價動物自主活動能力和運動協調能力。研究發現，與對照組相比，雌雄大鼠各劑量組的水平運動距離和在棒時間差異均無統計學意義，但雌雄大鼠的水平運動距離相差較大，提示硝酸鈰可能不會對大鼠的運動協調能力產生影響，但曠場實驗評價動物自主活動能力可能存在性別差異，需要進一步確證及機制探索。

流行病學調查研究顯示，與對照區兒童相比，稀土礦區兒童智商、注意力和學習記憶等認知能力明顯降低，引發學術界對稀土元素神經毒性的廣泛關注[23-24]。Morris水迷宮被廣泛用來評估嚙齒動物的學習記憶能力。既往研究主要以稀土元素鑭為關注點。有研究表明，飲水給予Wistar大鼠氯化鑭能夠增加定位航行實驗中的逃避潛伏期，降低大鼠穿過目標象限和原平臺的次數，提示稀土元素鑭會降低大鼠的學習記憶能力[25]，還發現經口灌胃ICR小鼠硝酸鑭，低劑量時小鼠在水迷宮中的反應時間和錯誤次數縮短，提示鑭元素具有低劑量興奮效應[26]。已有相關研究發現鈰能穿過小鼠血腦屏障，蓄積于小鼠海馬中，小鼠經口暴露氯化鈰60 d，劑量為20 mg/kg時，能夠引起海馬神經損傷及炎癥反應，從而使學習記憶能力受損，暴露90 d時，氯化鈰劑量低至1 mg/kg時，就觀察到海馬組織發生病理學損害[27-28]。但本研究行為學結果表明，與對照組相比，硝酸鈰各劑量組大鼠4 d定位航行實驗的逃避潛伏期差異無統計學意義。空間探索實驗中，進入目標象限次數、目標象限游泳時間及穿越平臺位置次數等指標與對照組相比，差異均無統計學意義。海馬在調控焦慮行為和學習記憶能力中發揮重要作用[29-30]。本次實驗對硝酸鈰各劑量組大鼠海馬組織切片HE染色后，也并未觀察到中毒病理特征。ICP-MS檢測結果顯示，SD大鼠硝酸鈰染毒后海馬組織中鈰元素的含量有一定的升高，但蓄積并不明顯。且雌、雄對照組(ddH2O)大鼠海馬組織中均有相對較高的稀土元素鈰，該現象也在相關稀土研究中發現[31-33]，提示實驗動物具有一定量的稀土元素本底值。這些結果提示硝酸鈰長期經口暴露可能并不會對SD雌雄大鼠的學習記憶能力產生損害作用，其原因可能是血腦屏障對稀土元素有一定的阻礙作用[34]，使得只有少量鈰元素蓄積在腦組織中。與已有小鼠研究結果的不一致，可能與物種差異有關，尚需進一步研究探討。

本實驗遵循OECD 424準則，從焦慮、運動協調平衡能力和學習記憶能力三方面評價硝酸鈰亞慢性暴露對SD雌雄大鼠神經行為的影響，發現SD大鼠灌胃給予500 mg/(kg·d)硝酸鈰并不會對其神經行為產生影響。Wu等[14]按300 mg/(kg·d)采用90 d經口暴露給予硝酸鈰，發現雄性大鼠體質量明顯降低，中高劑量組血生化和血象部分指標異常，建議硝酸鈰的NOAEL值為75 mg/(kg·d)。但本研究結果說明在硝酸鈰濃度為75 mg/(kg·d)時，硝酸鈰經口暴露可能不會對大鼠神經行為功能產生影響，為稀土元素鈰的健康指導值確定提供了進一步的科學依據。但動物行為模型本質上只是模擬神經系統疾病的特定癥狀，由于本次實驗評估方法的局限性，因此硝酸鈰對神經系統的影響與接觸風險還需要結合分子實驗進一步確認。