甘草干姜湯抗小鼠乳腺癌實驗研究

辛雨濛，梁桓熙，孫震曉

(北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102488)

據世界衛生組織國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)發布的2020年全球最新癌癥數據顯示，乳腺癌發病率高于肺癌，成為全球第一大癌癥[1-2]。乳腺癌多發生于乳腺導管上皮或腺小葉，是乳腺上皮細胞在多種致癌因子的作用下，發生增殖失控造成的[3-5]。現階段治療乳腺癌主要以手術治療為主，配合以放療、化療、內分泌治療等，但術后易復發，放化療易造成不良反應，利用中醫中藥治療既是一種輔助治療手段，又可明顯改善患者體質，減少復發轉移可能，降低化療放療的毒副作用，有效延長患者的生存期[6-8]。

甘草干姜湯(licorice and dried ginger decoction，LDGD)來自張仲景《傷寒雜病論》和《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣脈證治》。甘草甘溫而補中益氣，干姜辛溫而溫復脾肺之陽，全方躁烈性不強、藥性平和、具有補中復陽之功。乳腺癌在中醫常歸為“乳癌”“石榴翻花發”“乳巖”“乳石”“乳毒”“奶巖”等。現代中醫治療乳腺癌多為補虛益腎，疏肝健脾，行氣養血，與肝經、脾經、腎經的關系最為密切[9]。因此甘草干姜湯可能用于乳腺癌的治療。本實驗以荷小鼠乳腺癌細胞4T1的小鼠模型為研究對象考察甘草干姜湯的抗乳腺癌作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

1.1.1 LDGD的制備甘草、干姜等飲片購自安國市昌達中藥材飲片有限公司(甘草批號1801001，干姜批號1806001)。稱取甘草飲片30 g，干姜飲片15 g，加入450 mL純水，將中藥藥材投入圓底燒瓶，使用加熱回流的方式進行提取，從微沸時開始計時，2 h后轉移藥液，再加入360 mL純水進行提取，從再次微沸時開始計時，1.5 h后與之前藥液合并，離心除渣后利用旋轉蒸發儀濃縮，將濃縮后的藥液置于-80℃預凍，過夜后使用凍干機，凍干48 h，得到中藥凍干粉。根據最后所得凍干粉的質量和生藥量來計算凍干粉得率。

根據生藥量計算所需凍干粉的質量，精密稱取LDGD凍干粉，溶于相應體積的純水中，室溫震蕩溶解后，密封于4℃冰箱保存。

1.1.2 實驗試劑RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。DMSO、NCTD均購自Sigma公司；青霉素、鏈霉素溶液均購自Amresco公司；胰蛋白酶購自北京拜爾迪生物科技有限公司。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)購自Ameresco公司，氯化鈉(NaCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氫氧化鈉(NaOH)均購自北京化學試劑公司。

1.1.3 RPMI-1640完全培養基按照RPMI-1640培養基粉劑說明書進行配制，每1 L培養基中加入2.0 g NaHCO3，使用1 mol/L的NaOH/HCL調節pH至7.2～7.4，用0.22μm濾膜過濾除菌，使用前加入青霉素、鏈霉素和胎牛血清，4℃保存。

1.1.4 PBS緩沖液稱取0.2 g KCl、8 g NaCl、3.48 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KH2PO4，加1 L雙蒸水，攪拌溶解，1 mol/L NaOH調節pH至7.2～7.4，121℃、30 min滅菌，4℃保存備用。

1.1.5 胰蛋白酶量取100 mL PBS緩沖液，稱取0.25 g胰蛋白酶粉末溶解于PBS中，滴加2%酚紅兩滴，以1 mol/L的NaOH調節pH至8.0，加入0.02 g EDTA-Na2，0.22μm微孔濾器過濾除菌，得到含0.02%EDTA、0.25%的胰蛋白酶，4℃保存。

1.2 細胞系及動物

小鼠乳腺癌細胞4T1，來自本課題組，-80℃凍存；BALB/c雌性小鼠，購自北京斯貝福公司，合格證號SCXK(京)2019-0010。

1.3 主要儀器

低溫高速離心機和微量移液器，購于Eppendorf公司；電子天平，購于Mettler Toledo公司；高壓蒸汽滅菌鍋(AUTOCLAVE)，購于Sanyo公司；超低溫冰箱，購于美國Sanyo公司；倒置顯微鏡(TE2000-S)，購于Nikon公司；；低速軌道式搖床(SK-L330-Pro)，購于大龍興創實驗儀器(北京)股份公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞復蘇培養基放置至室溫，調節水浴鍋溫度穩定至37℃。將細胞自-80℃超低溫冰箱中取出，置于37℃水浴鍋中輕晃融化。在超凈臺內取無菌15 mL離心管，加入4 mL培養基，吸取融化的細胞懸液沿離心管壁緩慢加入，輕輕吹打混勻，1 000 r/min離心2 min。離心后棄去上清，加入1 mL培養基輕輕將細胞吹打均勻，取一個新的細胞培養瓶加入5 mL新培養基，將細胞懸液轉移至新培養瓶中，置于37℃、CO2體積分數為5%培養箱中培養。

1.4.2 4T1荷瘤小鼠模型的建立對小鼠乳腺癌細胞4T1進行體外細胞擴大培養，滿足實驗需求細胞數量，使用前進行消化、計數后重懸于PBS中，使用接種針將細胞懸液注射于小鼠右前肢腋下，每只小鼠接種1×106個細胞，每只0.2 mL。正常對照組在小鼠右前肢腋下注射等量的PBS。

1.4.3 給藥方案38只雌性BALB/c小鼠共分5組：正常對照組6只，模型對照組和LDGD低、中、高劑量組每組8只。從接瘤后次日起，LDGD低、中、高劑量組小鼠分別按0.1、0.3、0.9 g/kg灌胃給藥，每日1次，根據小鼠體質量對灌胃體積進行微調，使每只小鼠的灌胃體積均在0.2 mL左右。正常對照組、模型對照組灌胃蒸餾水，連續20 d。

1.4.4 指標檢測實驗過程中每天記錄小鼠體質量的變化，從第10天開始使用游標卡尺對腫瘤組織的最長徑(a/mm)和最短徑(b/mm)進行測量，用于計算腫瘤體積：瘤體積=1/2×a×b2。共給藥20 d，第20天給藥后禁食12 h，次日最后一次給藥后稱體質量，摘取眼球取血，4℃、3 000 r/min離心15 min收集血清，用于檢測肝腎生化指標：白蛋白(ALB)、血清堿性磷酸酶(ALP)、丙谷轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌 酐(CRE)、直 接 膽 紅 素(DBIL)、尿 酸(UA)。剝離腫瘤并解剖取其肝臟、腎臟、胸腺、脾臟組織，稱質量記錄。

1.4.5 腫瘤組織病理切片HE染色腫瘤組織4%多聚甲醛進行固定。將固定好的腫瘤組織進行石蠟包埋、切片、HE染色。染色后的腫瘤組織切片顯微鏡下觀察。HE染色后，蘇木素可將細胞核染成藍色，伊紅可將細胞質染成粉紅色。

1.5 數據處理及統計學分析

實驗數據采用SPSS 24和Graphpad Prism 7軟件進行統計學分析，數據用±s表示，使用單因素方差分析對多樣本均數進行比較，使用t檢驗對兩樣本均數進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

各組荷瘤小鼠剝離的腫瘤見圖1，可以看出，甘草干姜湯高劑量組小鼠的腫瘤體積顯著小于模型組。記錄給藥后第2～20天荷瘤小鼠體質量的變化(表1)，甘草干姜湯各劑量組與模型對照組相比差異無統計學意義。從第10天開始測量并記錄腫瘤體積變化，如表2所示，模型對照組腫瘤生長速度較快，體積較大，而甘草干姜湯給藥組的腫瘤體積隨著劑量的增加逐漸減小，生長速度變緩。

表2 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

圖1 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

表1 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠體質量的影響

剝離腫瘤后對腫瘤質量進行分析(表3)，結果顯示與模型對照組相比，甘草干姜湯高劑量組顯著抑制了小鼠腫瘤的生長，抑瘤率為(44.76±0.06)%(P＜0.01)，中劑量組抑瘤率為(15.68±0.21)%(P＜0.05)，而模型對照組、甘草干姜湯低劑量的腫瘤質量差異無統計學意義(P＞0.05)。

表3 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤質量的影響

2.2 甘草干姜湯作用后4T1荷瘤小鼠病理組織切片分析

荷瘤小鼠腫瘤組織切片HE染色后觀察(圖2)，可見與模型對照組相比，甘草干姜湯高劑量組的腫瘤壞死區域面積顯著增多，壞死區域腫瘤細胞存在細胞核固縮現象。

圖2 腫瘤組織切片HE染色分析

2.3 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠免疫功能的影響

與正常對照組相比，模型組和LDGD各劑量組的脾臟系數均顯著增加，但LDGD低、中劑量組的脾臟系數、胸腺系數與模型對照組比均無明顯變化；LDGD各劑量組的脾臟系數隨濃度增加逐漸減小，LDGD高劑量組的脾臟系數與模型對照組相比顯著降低(表4)。

表4 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠免疫器官的影響

2.4 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠肝臟、腎臟功能的影響

與正常對照組相比，模型對照組和LDGD各劑量組的肝臟系數均顯著增加；但LDGD各劑量組的肝臟系數、腎臟系數與模型對照組比無明顯變化(表5)。與正常對照組相比，模型對照組和LDGD各劑量組的ALP、ALT、CRE水平降低，BUN水平升高，而與模型對照組相比，LDGD各劑量組的各指標均無顯著性差異(表6)，LDGD對小鼠肝腎功能指標均無明顯影響。

表5 甘草干姜湯對荷乳腺癌4T1小鼠肝腎系數的影響

表6 甘草干姜湯對荷小鼠乳腺癌4T1小鼠肝腎血生化指標的影響

3 討論

本研究結果表明，LDGD可以抑制4T1荷瘤小鼠的腫瘤生長。給藥20 d后，GDLD高劑量組荷瘤小鼠的腫瘤體積比模型組顯著減小，對腫瘤質量的抑制率可達(44.76±0.07)%；GDLD各劑量組小鼠體質量與模型組相比差異無統計學意義，腫瘤組織病理切片分析表明GDLD高劑量組的腫瘤壞死區域面積顯著增多；LDGD低、中劑量組的脾臟系數、胸腺系數與模型對照組相比沒有明顯變化，說明藥物自身對小鼠的胸腺和脾臟影響不大，而LDGD各劑量組的脾臟系數隨濃度增加逐漸減小，LDGD高劑量組的脾臟系數與模型對照組有顯著差異，說明LDGD有助于小鼠脾臟功能的恢復；與模型對照組相比，LDGD各劑量組的肝腎系數無顯著性差異；與正常對照組相比，模型對照組和LDGD各劑量組的ALP、ALT、CRE水平降低，BUN、O/P水平升高，而與模型對照組相比，LDGD各劑量組的各指標均無顯著性差異，說明模型對照組和LDGD各劑量組小鼠的肝腎血生化指標變化由荷瘤引起，LDGD對小鼠肝腎指標無明顯影響，說明LDGD無明顯肝腎毒性。上述實驗結果表明，LDGD在實驗劑量范圍有一定抗腫瘤作用，無明顯的肝腎毒性和免疫抑制作用。

目前利用甘草干姜湯研究抗腫瘤作用的實驗研究較少，但有報道其作用于其他功能的研究進展。例如甘草干姜湯以0.96 g/kg的劑量，給藥28 d可以調整大鼠體內Th1/Th2的比例，進而調節白介素IL-2、IL-5、IL-4、干擾素IFN-γ的表達，增強免疫功能，改善變應性鼻炎的癥狀[10-12]；甘草干姜湯以2 g/kg的劑量，給藥28 d作用于大鼠還能提高肺組織超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，降低脂質過氧化物的水平，清除體內過多的自由基，增強抗氧化防御系統，同時調控TGF-β和SIRT1的表達，抑制肺纖維化[13-15]。

本研究初步探討了甘草干姜湯體內抗乳腺癌作用及對主要免疫器官胸腺及脾臟、主要藥物代謝器官肝臟和腎臟的作用，明確了甘草干姜湯具有一定的抗乳腺癌作用，并且無明顯的肝腎和免疫毒性。本研究為甘草干姜湯臨床用于乳腺癌治療提供了一定數據支持，也有助于基于甘草干姜湯的抗腫瘤中藥新藥研發，下一步需結合生物信息學、藥物化學和分子細胞生物學技術進一步揭示甘草干姜湯抗腫瘤的作用機制。