關于實驗動物運動模型建立的倫理思考*

肖楚蘭 陳嬌嬌 郭冰潔 殷子斐 常運立 李 柏

在歷年的研究過程中，不管是眾多的前瞻性研究還是動物實驗研究，強有力的科學證據表明：運動已經作為一種非侵入性和非藥理學的疾病防治方式在心血管、神經、內分泌等多種系統疾病的防治中發揮著積極作用[1]。

一個完整的運動實驗包含實驗動物的種屬選取、運動模式的選擇，以及運動方式、運動頻率、運動強度、持續時長等運動元素的確定等多個環節。這整個過程中存在著一系列的倫理問題值得我們去探討，只有對實驗動物充分進行倫理關懷，以及對其福利進行充分地思考與落實，使其各項生理指標達到最佳狀態，才能得到可信服的實驗結果[2]。研究人員也不會因自己不能很好地減少實驗動物的痛苦而感到過多的愧疚與不安[3]。目前，已有部分國內外學者對化學誘導的腸道炎癥動物模型[4]、兔VX2肝癌模型[5]、顯微外科血管插管模型[6]、大腦損傷模型[7]、骨骼肌肉系統[8]等動物模型進行了倫理分析，然而沒有關于運動模型倫理思考方面的研究報道。筆者將結合自己既往的科研經驗，就實驗動物運動模型建立過程中應該注意的倫理關懷以及動物福利等問題展開論述，以促進研究人員更多地關注實驗動物福利，并將其運用于動物運動模型的建立過程中。

1 實驗動物倫理

實驗動物倫理概念的提出是出于對實驗動物人道主義的關注，以生命倫理準則來規范動物實驗，使人類能夠遵循相關倫理制度，減少動物實驗對動物所造成的傷害[9-10]。目前，實驗動物倫理廣為應用的兩大基本準則有3R原則以及5F原則。兩者切入點不同卻又相互補充，相輔相成，使實驗動物倫理更為全面和科學，而且將動物福利的實現達到最優化。

3R原則是針對動物實驗而提出的實驗原則：(1)減少(reduction)；(2)替代(replacement)；(3)優化(refinement)[11]。3R原則主要聚焦于從根源上減少動物實驗的倫理問題，包括實驗前動物的選擇以及減少實驗的動物數量。而5F原則是旨在提高動物福利的一項基本原則，即減少動物(尤其是受人類控制的)不必要的痛苦，廣泛應用于各個領域，也包括動物實驗：(1)免受饑餓的自由(freedom from hunger and thirst)；(2)生活舒適的自由(freedom from discomfort)；(3)免受痛苦的自由(freedom from pain,injury and disease)；(4)免受焦慮的自由(freedom from fear and distress)；(5)表達天性的自由(freedom to express normal behavior)。5F原則的應用更加傾向于實驗動物生存環境的改善與實驗進程中的操作方法優化[9]。

2 運動方案基本要素

一個完整的運動方案包括運動方式、運動強度、運動頻率、持續時長。一般而言，實驗動物的運動方式主要包括跑步機跑步、游泳、負重爬梯、自愿輪跑以及挖洞[12-15]，其他還有電刺激蹲跳、電刺激仰臥起坐[16-17]等不常用的運動方式。根據運動能量代謝的不同可以分為有氧運動和無氧運動[18]。而從實驗動物倫理角度而言，根據實驗動物本性是否愿意參與這項運動，可以將運動方式歸類為強迫與自愿的運動模式[19]，這值得我們深入剖析與思考。

自愿運動主要包括自愿輪跑和挖洞，研究人員只需提供可記圈的跑輪或挖洞條件，動物會基于本能而產生運動行為。而強迫運動需要外界的刺激而進行運動，主要包括跑步機跑步、游泳、負重爬梯，其他不常見的還有電刺激蹲跳等。除了運動方式之外，運動強度是強迫運動特征性要素，跑步機跑步主要通過調整速度、時長和坡度；游泳通過改變時長和負重；負重爬梯則是調整爬梯角度、梯距和次數。運動頻率和持續時長在各種強迫運動方式之間基本無差別(運動頻率以每周5天～7天為主；持續時長≤6周為短期運動，>6周為長期運動)[1]。而自愿運動不用考慮運動強度和運動頻率，持續時長則同強迫運動。

此外，運動方案還可細分為三個階段：適應階段、訓練階段、恢復階段。適應階段是實驗動物在進行任何運動形式的訓練計劃之前都需要進行的訓練階段，在這一階段研究人員應給予1周～2周時間讓實驗動物循序漸進地去適應它們的運動環境。之后訓練階段則按照制定的訓練計劃進行實施。恢復階段則包括實驗動物運動訓練之外的所有時間[1]。 動物倫理與實驗動物運動模型建立的概覽圖，見圖1。

圖1 動物倫理與實驗動物運動模型建立

3 實驗動物運動模型相關倫理分析

3.1 運動訓練前的倫理

3.1.1 動物種屬

在運動訓練前實驗動物的選擇中，主要遵循3R的減少和替代原則[20]。對于運動實驗而言，它涉及到醫學各個領域，包括心血管系統、神經系統、消化系統、呼吸系統等[21-23]。運動實驗動物也包括常見的鼠、兔、犬、豬，甚至是猴，所以這就要求我們在實驗動物選擇中盡量以低等生物代替高等生物，預實驗中更是應當以低等生物為主[24]。就目前而言，運動動物模型造模一般選取鼠類，因為鼠類實驗動物往往能滿足大部分實驗的需要。此外，鼠類實驗動物相較于其他高等實驗動物更為經濟。但是，由于某些特別需求，更為高等的實驗動物也會被應用于運動實驗。例如，運動對于心血管系統的影響是目前運動實驗的熱點之一。由于豬與人類的心臟在大小、結構、工作原理上基本一樣，許多人員在研究運動對于心血管系統的影響時也會選擇豬作為實驗對象。Zheng等[25]在研究運動對冠狀動脈循環中的肌球蛋白磷酸酶的影響時便選擇了豬為實驗對象，此外，他們還在豬的左回旋支動脈周圍放置了Ameroid收縮器，小型實驗動物將很難滿足這一點需求。

3.1.2 運動模式

對于運動模式的選擇而言，一般性干預條件如給藥、種植皮下瘤等在不影響實驗動物運動水平的前提下并不會影響運動模式的選擇。然而，當我們將目光聚焦到動物本身的意愿時，其中有許多問題值得我們深入探討。可以說自愿模式是一種體育活動模式，是實驗動物出于新陳代謝需要或是出于運動本能的一種自愿行為。例如，Roemers等[12]根據鼠類挖洞的生活本能提供運動組小鼠食物顆粒、木屑或密度更高的材料的穴居條件，通過小鼠從洞穴中取出的基質量來量化動物所做的工作量。除此之外，自愿輪跑是提供運動組小鼠一個可記圈數跑輪來量化小鼠的運動量。相對于自愿模式，強迫模式更像是一種運動訓練模式，即有組織和有目的的體育活動，是研究人員根據自己的需求而強加在動物身上的一種訓練方式[26]。實驗動物每周甚至是每天在固定的時間需要完成固定的運動量，而這不是出于實驗動物本身的選擇。

從5F原則中免受痛苦、免受焦慮、表達天性三個角度而言，自愿性運動(如自愿輪跑、挖洞)相較于強迫性運動(如跑步機跑步、游泳)給實驗動物帶來更多的是天性的表達，而不是痛苦和焦慮，更不是求生欲所驅使下的運動。動物本能運動行為即自愿性運動，相較于強迫性運動，更加符合動物倫理關懷與動物福利的要求。此外，從實驗角度而言，有研究分別檢測記錄了人類自愿性體力活動和強迫性運動訓練前后的血清皮質酮和糞便皮質酮代謝物含量變化，結果發現自愿性體力活動所誘導的含量變化顯著低于強迫性運動訓練。而這兩項指標與動物壓力應激因素息息相關，這將會影響到實驗本身的可信度[26]。所以兩種運動模式所引起的其他應激或者生理變化也應當納入運動方案設計的研究之中。 另外一點值得思考的是，在強迫性運動中，研究人員可以通過改變運動參數來精準控制實驗動物的運動強度從而探索不同強度的運動對于實驗動物的影響。例如，Xie等[27]將雌性C57BL/6腦脊髓炎小鼠的中強度游泳運動干預建模方案設置為：小鼠每天游泳50分鐘，0%體重負荷，5天/周，6周以上。而高強度組采用4%體重負荷以改變運動強度。自愿性運動的運動強度只能通過儀器測得的數據來測算實驗動物的運動量，不能夠有效地控制運動強度和持續時長。

自愿運動相較于強迫運動更加符合5F原則，強迫運動也有其不可或缺的優勢。研究人員應當在自愿運動與強迫運動之間探索一種折中的運動模式，同時滿足研究人員的實驗需求以及實驗動物的倫理需求。而目前在進行強迫運動實驗時則更加應當關注運動干預過程中對實驗動物的倫理關懷。

3.1.3 運動劑量

對于運動劑量問題而言，其中最突出的問題便是運動強度的判定，目前對于實驗動物最大運動強度的判定方法至今并未達到一個共識。盡管目前以錨定比例測量，如最大攝氧量、峰值攝氧量、最大心率和最大工作效率為主要測量方法。其他包括通氣閾、氣體交換閾、呼吸補償點、最大乳酸穩態等也被嘗試應用于運動強度的界定中[28]。動物運動實驗缺少一個統一標準來規范運動強度的判定。出于無統一標準，缺少設備、減少實驗損耗等原因，部分研究人員選擇直接參考文獻來決定自己研究的運動強度，許多論文中甚至沒有提及實驗動物的運動強度的測定方式。這也將導致一個極其混亂的研究局面。

首先，不同實驗中實驗動物的疾病造模在一定程度上也會影響到其運動能力。例如，在其他運動元素大致相同的情況下，Yi等[29]將C57BL/6J高脂飲食肥胖小鼠的中強度游泳運動強度設置為每次游泳20分鐘，而Xie等[27]的C57BL/6腦脊髓炎小鼠中強度游泳運動強度為每次游泳50分鐘，肥胖小鼠的運動能力顯然遠不及腦脊髓炎小鼠。盲目的以種屬為分類來參考運動強度將會使整個實驗產生巨大偏差。即使是相同種屬的相同疾病模型也會因為批次等其他因素的不同而產生較大誤差。這將會導致不規范、超劑量或不符合現實的高強度運動被應用于運動動物實驗，進而對實驗動物帶來過多的負擔而造成潛在或顯性傷害，甚至會造成實驗動物發生死亡的情況。所以研究人員都應當采取一個共同的測量方式對其實驗動物進行預測試從而確定運動強度，而不是僅僅參考文獻資料而給自己的實驗動物確定相同的運動強度。

其次，從測量方式上來講，氣體相關測量方式是通過呼吸氣體測試儀、固定跑臺、功率自行車、臺階、手搖功率計等來測量，該方式可以不斷重復使用，但是設備條件將限制部分實驗室的使用[30]。而最大乳酸穩態測量方式需要對實驗動物進行采血來測定血液乳酸含量[31]，雖然簡單易操作，但是重復使用會對實驗動物造成一定傷害。

3.2 運動訓練中的倫理思考

3.2.1 適應階段

在適應階段過程中，實驗動物需要習得如何在諸如聲音、燈光和電子沖擊等物理刺激的作用下，在某種形式的運動中調整自己的行為。一般而言，實驗動物在初次接觸游泳、跑步機跑步等強迫性運動形式時會有很強烈的應激反應。而適應階段能夠很好地將實驗動物置于一種較為舒適的訓練環境中，并且在適應的前提下慢慢地減輕實驗動物在進行運動實驗所產生的一系列應激反應，包括痛苦、焦慮等負面情緒的產生，為后期實驗動物完成正式實驗計劃打下堅實的基礎，這也更符合動物福利以及動物倫理的要求。在這一階段結束時，實驗動物也應當已經能夠適應相應環境并按照實驗計劃完成相應的運動方案。例如，Chan等[32]為了讓實驗小鼠能夠完成10米/分鐘，持續60分鐘的跑步機跑步運動強度，他們在小鼠的適應階段，讓運動組最開始以6米/分鐘的可接受速度適應訓練方案，并在適應期逐步提高到10米/分鐘,運動時間逐步延長至15分鐘/天，直到運動時間能夠達到60分鐘/天，運動強度的漸進式提升使小鼠逐步適應了60分鐘/天的運動強度。

3.2.2 訓練階段

訓練階段往往需要我們從細節上更加去關注動物福利，主要遵循優化原則，盡量將實驗過程中的操作細節化，將實驗動物的痛苦體驗降到最小。由于自愿性運動是實驗動物根據本能而進行的運動方式，所以此處筆者以常用的強迫性運動為例展開介紹。

3.2.2.1 游泳

在水池中，實驗動物原始的求生欲會促使其保持游泳狀態，不需要其他外力刺激強迫其進行運動，見圖2A。為了提高實驗動物在游泳過程中的舒適度，實驗動物的游泳水溫需要保持在一定的溫度(30℃左右)。待實驗動物游泳結束后應立即用抹布將其擦干，并以輕撫等動作來使其安定，減少其痛苦焦慮的情緒，這樣可以減少實驗動物在實驗過程中出現意外情況，也是對實驗動物福利的一種體現。與此同時，當強迫式游泳運動涉及到中高強度或者高強度時，研究人員需時刻觀察實驗動物的運動狀態。在Netto等[33]的雌性成年Wistar妊娠大鼠游泳實驗中，他們讓大鼠在懷孕第7天～第20天進行游泳，每天30分鐘，低強度運動組1%體重負荷，中強度運動組4%體重負荷，高強度運動組7%體重負荷。7%體重負荷如果超出了當天大鼠的可承受范圍，大鼠可能會出現沉底、連續“冒泡”和游泳動作明顯變形等情況。這時候需要及時確認大鼠是否已達到力竭狀態并及時撈出，避免“嗆咳”甚至“溺亡”的情況發生。如果動物發生嗆咳而導致其不能進行下一步實驗時，根據實驗動物的痛苦程度，研究人員需決定是否提前處死實驗動物以減輕其所受的痛苦。

3.2.2.2 跑步機跑步

由于游泳運動的特殊性，實驗動物可能不得不游至“力竭”狀態以尋求生機。而不同于游泳運動，跑步機運動(見圖2B)中更多存在的是實驗動物配合度不夠的情況。這是因為跑步機運動本來就屬于強迫性運動范式，當跑步機速度或坡度超出了實驗動物的舒適范圍，它們可能會因為自己的主觀意愿而出現配合度不夠的情況，即跑步減速或是直接停留在跑帶上。這種情況不僅僅會出現在高強度的跑步運動中，低強度、中等強度同樣也會出現不愿意奔跑的情況。這時候就需要一些外源刺激促使它們繼續奔跑。Kang 等[34]對他們的低、高強度組的雄性C57Bl/6衰老小鼠就會采取輕戳后腿或者輕微電擊刺激來迫使其繼續完成實驗要求，該刺激也不能過大從而導致實驗動物強烈的應激狀態發生。但是，如果外源刺激也不能促使實驗動物完成訓練計劃，那么該運動強度可能已經遠超了實驗動物可承受范圍，建議更改實驗計劃。

此外，相較于游泳運動所導致的“嗆咳”和“溺水”，跑步機運動對研究人員的注意力要求更高。因為實驗動物造成的傷害往往更為迅速，這里并不是指死亡，而是實驗動物很有可能會在跑步機的夾縫中受傷，并因此不能完整結束實驗計劃甚至發生死亡的情況，這也可能是實驗動物本身并沒有意識到的危險因素。此時實驗動物的處死是很必要的，這也將大大地增加實驗動物的用量以及痛苦程度。

3.2.2.3 負重爬梯

負重爬梯(見圖2C)在實驗過程中需要不斷地對實驗方案進行調整以便實驗動物能夠完整地完成運動方案。同跑步機跑步一樣，實驗動物很容易出現倦怠的情況，并影響實驗的進程，需要研究人員進行反復的刺激以迫使實驗動物完成方案，研究人員施加的刺激應當相對輕柔，只要能夠驅使實驗動物進行攀爬就已經足夠。同時，負重爬梯實驗的后期負重往往會逐步增加到體重的75%、90%，甚至是100%[35]，研究人員應當細心地觀察實驗動物的爬梯狀況，以免其在實驗進程中跌落受傷而不能完成后續訓練計劃。雖然很難出現直接死亡的情況，但出于免除痛苦的原因，研究人員也應當處死受傷的實驗動物，這樣也會增加實驗動物的用量。

3.2.3 恢復階段

該階段研究人員應當關注實驗動物的身體狀態，及時發現實驗動物可能因為運動而出現的生理不適或者是疾病等狀況。在此階段，實驗動物也應當被提供很好的生活環境，包括足夠的空間、食物等，以便其很好地恢復從而進行下一輪運動訓練。

圖2 強迫性運動圖例及注意事項

3.3 實驗動物的處死取材

運動動物模型的處死取材與其他實驗動物模型一致，一般采取吸入二氧化碳、靜脈或腹腔注射過量巴比妥類藥物、過量麻醉、麻醉后放血等方法，讓實驗動物在無痛苦的環境中終止生命[5]。同時，在實施安樂死時不應該讓其他實驗動物看到，以免其他實驗動物產生恐懼心理[36]。待所有實驗動物安樂死后，應當將其尸體包裹并置于冰柜內暫時保存，之后進行無害化處理，這不僅是生物安全的必須要求，也是人類對實驗動物為人類健康事業貢獻出生命的一種感激的表現以及對實驗動物倫理關懷的體現，這也能在一定程度上減輕研究人員對于處死實驗動物而感到的不安，甚至是倫理上的困惑[37]。

4 結語

運動作為一種有效的非藥物療法，其有效性已經在多個系統疾病中得到證實，潛在研究價值巨大。尤其是運動療法的多靶點性使得其在疾病的防治過程中較傳統治療方式有著特殊的優勢。然而，實驗動物運動干預的過程中涉及到的諸多倫理問題也應當引起研究人員的高度重視。對于生物或醫療領域的工作人員而言，對實驗動物進行倫理關懷是其高尚人文精神的體現，也是實驗動物的福音所在。