基于網絡藥理學的過敏煎治療過敏性哮喘分子機制研究?

陶 鑫，薛中峰，覃驪蘭

廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001

過敏性哮喘是一種以IgE 介導的，由變應原引發的過敏性哮喘疾病，易感人群容易出現喘息、氣促、胸悶和咳嗽等由炎癥引起的癥狀［1］。過敏性哮喘是一種相對難以治愈的疾病，如果忽視治療，則遷延不愈甚至伴隨終生。過敏性哮喘屬中醫學“哮證”范疇［2］，病機多以痰為主，由肺脾腎功能失常導致。津液凝聚，痰聚于肺，受外邪、情志、飲食等因素引而發之。

現代醫學治療過敏性哮喘多用地塞米松腎上腺皮質激素，療效不甚理想，且有嚴重的副作用如滿月臉、水牛肩等。中醫藥以整體調節的優勢在防治哮喘復發和加重方面具有確切作用［3］。

過敏煎（Guomin Jian，GMJ）為名老中醫祝湛予所創名方，臨床常用于治療多種過敏性疾病，如過敏性哮喘、過敏性皮炎、腸易激綜合征等。方中防風發散解表，善于祛風，善治諸般風疾；銀柴胡清熱涼血，發散風寒；五味子味酸性溫，固精斂汗；甘草補脾益氣，全方正合哮證病機。防風的主要成分為防風色酮、升麻素，具有解熱、抗炎功效；銀柴胡的主要成分為甾醇類、環肽類，有抗炎、擴張血管作用；五味子含五味子素、五味子多糖，具有興奮呼吸中樞，止咳祛痰作用；甘草含有甘草苷和甘草酸，具有抗菌消炎作用。由于中藥復方成分復雜，作用機制不清，發掘復方的潛在分子機制仍然困難。隨著網絡藥理學的提出，單一靶標的研究逐步轉向整體、系統的調節研究，通過生物數據庫構建“中藥-有效成分-靶基因-疾病”可視化中藥調控網絡，進而闡明中藥復方的作用機制，實現分子作用的綜合網絡分析，最終從整體角度了解中藥與機體的相互作用［4-5］。因此，本研究運用網絡藥理學方法研究過敏煎治療過敏性哮喘的作用機制，進行從單一到整體、從部分到系統的研究，現報道如下。

1 方法

1.1 復方有效成分及靶點獲得通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索過敏煎中藥的化學成分，并根據化合物類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%篩選藥物活性成分。通過Uniprot 數據庫規范篩選出的靶點名稱，建立藥物活性成分靶點數據集的Drug.txt文件。

1.2 疾病相關基因獲得檢索詞：Allergic asthma，在Genecards（https：//www.genecards.org/）與OMIM（https：//omim.org/）兩個數據庫中檢索疾病相關基因；將上述預測靶基因合并作為疾病相關基因數據的Disease.txt文件。

1.3 藥物治療疾病的可能靶點獲得采用Draw Venny Diagram在線程序（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將Disease 和Drug 靶基因取交集獲得單味藥與疾病的共同靶點，此集合為單味藥治療疾病的可能靶點，生成Drug-Disease.txt文件。

1.4 藥物、疾病、靶基因網絡圖繪制采用Cytoscape 3.7.1繪制藥物、疾病、靶基因網絡圖。

1.5 PPI 網絡構建將Drug-Disease.txt 中的基因提交至String 網站（https：//string-db.org/），minimum required interaction score為highest confidence：0.900生成PPI互作網絡圖及string-interactions.tsv 文件（使用0.900結果）。相關網絡參數見文件夾下“參數.txt”。

1.6 統計條圖生成利用perl語言，在stringinteractions.tsv 文件提取關鍵基因連接度蛋白統計條圖（排名前30），所有節點連接度統計結果見count.xls文件。

1.7 基因名稱轉換為基因ID利用R3.6.0 軟件，安裝RSQLite 包及org.Hs.eg.db 包，將Drug-Disease.txt 中基因名稱轉換為基因ID，為京都基因(gene ontology，GO)和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析做準備，生成id.txt文件。

1.8 GO 分析利用R3.6.0 軟件，安裝Bioconductor 的colorspace、stringi、DOSE、cluster-Profiler、pathview、ggplot2等程集包，根據id.txt文件進行GO 富集分析，獲得條圖和氣泡圖（展示前20 條統計學最顯著結果）；將基因id 轉換為基因Symbol，獲得所有統計顯著性結果Excel 形式的統計文件GO.xls。利用ggplot2程集包進行GO的BP、CC、MF 分類輸出，條圖及氣泡圖存儲在GO2文件夾下。

1.9 KEGG分析利用R3.6.0軟件，安裝Bioconductor 的colorspace、stringi、DOSE、cluster Profiler、pathview 等程集包，根據id.txt 文件進行KEGG 富集分析，獲得條圖和氣泡圖（展示前20 條統計學最顯著結果）；將基因id 轉換為基因Symbol，獲得所有統計顯著性結果Excel 形式的統計文件KEGG.xls及通路圖文件。

2 結果

2.1 過敏煎的有效成分得到復方中銀柴胡10個、烏梅8個、甘草91個、五味子8個、防風18個，共計141個活性成分。化合物主要包括：五味子素C（WuweizisuC）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（Stigmasterol）、異鼠李素（isorhamnetin）等，具體活性成分的OB（生物利用度）和DL（類藥性）值見表1。

表1 過敏煎活性成分的OB和DL值（排名前30）

2.2 過敏煎活性成分-治療過敏性哮喘靶點預測將TCMSP、DrugBank 數據庫得到的所有靶點，由OMIM和Genecards數據庫篩選整合得到過敏性哮喘相關作用靶點共1708 個，將過敏煎活性成分與過敏性哮喘相關靶點取交集得到134 個藥物有效成分-疾病相關靶點。見圖1。

圖1 過敏煎活性成分靶點與過敏性哮喘的靶點預測結果

2.3 網絡構建及分析通過Cytoscape 3.2.1軟件將上述預測篩選結果構建網絡：過敏煎活性化合物治療過敏性哮喘靶點網絡圖見圖2—3。

圖2 過敏煎活性成分靶點與過敏性哮喘作用靶點

可知過敏煎治療的核心靶點為STAT3、JUN、RELA、AKT1、MAPK1、MAPK3 等，為了進一步了解過敏煎對過敏性哮喘的治療作用，將韋恩圖得到的134 個交集基因靶點通過STRING 數據庫進行PPI網絡分析，結果見圖4。

圖4 過敏煎治療過敏性哮喘潛在靶點之間的互作網絡圖

2.4 GO分類富集分析經DAVID數據庫分析，共得到141 條富集結果，選取P 值排名前20 的做GO分類富集分析，結果顯示過敏煎治療過敏性哮喘的生物過程主要為細胞因子受體結合、細胞因子活性、蛋白磷酸酶活性與結合等。見圖5。

圖5 過敏煎治療過敏性哮喘GO分類富集分析

2.5 KEGG 分類富集分析利用DAVID 數據庫對過敏煎的基因進行KEGG 通路富集分析，共獲得164 條通路，見圖6。前20 條富集結果主要為AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號傳導途徑、TNF 信號通路、HIF-1 信號傳導途徑、Toll 樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路等。

圖3 過敏煎治療過敏性哮喘的重要靶點柱狀圖

3 討論

中藥成分復雜、配伍靈活的特點使其在過敏性疾病（過敏性哮喘、過敏性鼻炎、蕁麻疹）的治療中與西藥相比具有優勢，但其局限性在于起效較慢，作用機制不明確。伴隨著網絡藥理學的興起，大數據分析和“多成分-多靶點”研究方法的廣泛應用為中藥作用機制研究提供了新方法［6］。本研究通過網絡藥理學技術，結合對應的數據庫和軟件，對過敏煎治療過敏性哮喘的作用機制進行研究，從方中防風、烏梅、銀柴胡、五味子、甘草中篩選，共獲得141 個活性成分，與疾病的交集基因靶點134個和164條通路，說明過敏煎治療過敏性哮喘是多成分多靶點共同作用的結果。

本研究結果顯示，在化合物靶點網絡中異鼠李素（isorhamnetin）可以抑制肺腫瘤細胞A549的生長，從而抑制MMP2 和MMP9 蛋白表達［7］，β-谷固醇（beta-sitosterol）對LPS 所致小鼠急性肺損傷有較好保護作用，其保護機制可能與阻止炎癥因子（TNF-α、IL-6）的釋放和下調NF-κB 信號轉導通路的活化有關［8］，山奈酚能夠緩解氧化低密度脂蛋白誘導的人靜脈內皮細胞損傷，這與山奈酚促進AMPK/Nrf2/HO-1信號通路的激活有關［9］。

GO 功能富集分析結果顯示，過敏煎的療效涉及多個生物過程，主要以細胞因子受體結合、細胞因子活性、蛋白磷酸酶活性與結合等為主，白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）主要是由Th17細胞分泌，是常見促炎因子，可以促進白細胞遷移和活化，在自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發揮重要作用［10］。

KEGG 通路分析顯示，過敏煎治療過敏性哮喘涉及多個通路，主要為AGE-RAGE 信號通路、IL-17信號傳導途徑、TNF 信號通路、HIF-1 信號傳導途徑、Toll 樣受體信號通路等。大量研究發現，Th17 細胞是一類強有力的促炎細胞，可動員、募集和活化中性粒細胞，并與其所產生的細胞因子如IL17A、IL17F 等共同參與自身免疫性疾病如RA、哮喘、SLE、銀屑病、MS等疾病的病理進展［11-12］。NF-κTHFα通路貝母素甲與TNF-α能下調炎癥反應信號通路中MAPKs磷酸化水平，降低B基因的轉錄強度，從而減少TNF-α、IL-6 等促炎細胞因子表達［13］。故IL-17 信號通路和TNF 信號通路為本研究所預測的主要通路。用卵清蛋白誘導的哮喘小鼠Toll 受體模型、BML-111 或IL-1β抗體治療均能阻止其炎癥變化［14］。

綜上所述，基于網絡藥理學方法和技術分析的過敏煎治療過敏性哮喘的活性成分、靶點以及信號通路等，從多層次、多角度經過多次篩選重要活性成分，獲得的重要信號節點是網絡藥理學的特點［15］。本研究從數據網絡角度分析過敏煎治療過敏性哮喘的作用機制，為以后探究過敏煎治療機制提供了思路與基礎，但具體作用機制還需進一步研究與驗證。