黃芪甲苷抗腎纖維化的相關分子機制研究

盧海霞，覃柞蓮，陸麗娟，吳炳瑤，謝 麗，李 麗

廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530001

現代醫學研究表明，腎纖維化主要與成纖維細胞的活化和增殖、炎性細胞的浸潤及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的積聚密切相關，因此，積極開發阻斷炎癥、抑制細胞凋亡、減輕間質ECM 的過度沉積、提高免疫力的藥物顯得彌足重要［1-5］。目前，抗腎纖維化的西醫常規藥物包括免疫抑制劑、激素、血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）/血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）類等藥物，但這些藥物在抗腎纖維的進程方面沒有顯示出抑制腎臟纖維化的優勢。因此，愈來愈多的學者開始從中醫藥寶庫中的中藥單體、中藥復方中尋求治療措施，以彌補現階段腎病常規藥物治療所面對的窘迫處境。國內外研究［6-8］已證實黃芪對保護腎臟、治療慢性腎臟疾病有顯著效果，具體機制主要為保護腎小管細胞、抑制腎纖維化、保護足細胞等方面，其中黃芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）是黃芪中含量最高、活性最為廣泛及占主導地位的有效成分之一。故現代醫學中AS-IV 也被廣大醫者運用于慢性腎臟疾病的治療中。其中，諸多研究證實AS-IV 具有抑制纖維化［9-12］、抗炎［13-14］、抗凋亡［15-18］等作用，因此在抗腎纖維化領域具有顯著成效，具有廣泛的應用前景。故本文通過綜述AS-IV 抗腎纖維化的分子機制，為該藥進一步臨床研究及接下來開發利用提供參考依據。

1 腎纖維化的病因

腎纖維化主要特征為腎組織的破壞及腎功能由健康到逐漸喪失的漸進過程，主要機制為腎臟由于創傷、感染、免疫反應等一系列致病因素，如藥物中毒、糖尿病、高血壓、感冒等刺激，致使ECM產生的重要效應器成纖維細胞被過度激活，以ECM 不斷產生和積累為特點，因此，成纖維細胞的過度激活被視為腎纖維化發病機制的一個關鍵拮抗因素［18-19］。

2 腎纖維化的病理生理機制

原發性和繼發性的腎臟病理刺激損傷均可引起腎臟組織內微循環代謝障礙，致使腎組織缺血和缺氧，使腎臟毛細血管內皮細胞受損，從而誘導炎性細胞浸潤且釋放類似白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎性介質，并逐漸積累可漸進性導致腎臟發生纖維化改變。腎臟組織纖維化后可釋放結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等生長因子和許多毒性細胞因子。后者可導致表型轉化，甚則分泌及合成一系列ECM 類介質，如膠原纖維蛋白I 型與Ⅲ型。由于它們不易被降解的特質，致使ECM 不斷被生成并大量積累，導致發生腎小球硬化、腎間質及血管纖維化或進程加劇。腎纖維化漸行性的不斷發展，最終發展成為瘢痕組織，同時伴隨腎功能的逐步減退，最終形成終末期腎臟病（end-stage renal disease，ESRD）［20］。目前國內外研究探討與腎纖維化關系最為密切的病理生理機制如下。

2.1 TGF-βTGF-β是慢性腎臟病中的一種由許多腎細胞合成可啟動并調節一系列病理生理過程的促纖維化細胞因子。在腎臟疾病中，TGF-β通常可通過有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）及Smad 等信號通道顯著上調，以促使腎組織細胞過度產生ECM蛋白，從而導致腎小管間質纖維化。不同類型的腎細胞誘導后，經過一系列的病理生理變化，通常最終致使細胞肥大，甚至凋亡及足細胞的足突異常，從而導致腎功能不全［21］。腎纖維化是ECM過度產生與積聚到一定程度后最為常見的結果，常發生于糖尿病性腎病和膜性腎病。TGF-β被認為是調控腎小管上皮間充質轉分化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的重要調節因子。除了參與調控ECM 蛋白合成及腎細胞凋亡、肥大和增殖外，還參與蛋白激酶和轉錄因子等多種細胞內信號轉導途徑［22］。TGF-β家族成員之一TGFβ1刺激腎小管上皮細胞促進ECM 的主要來源之一α-平滑肌肌動蛋白α-SMA的表達。而TGF-β1被阻斷后，α-SMA 表達減少，表明TGF-β1能夠促進ECM過度產生及積累，致使細胞外基質形成，最終促進腎小球發生纖維化［23-26］。

2.2 ECM腎間質纖維化通常由生長因子、血管生成因子、纖維細胞因子和蛋白酶等分子致使發生慢性炎癥，進而刺激ECM 成分過度產生與超負荷積累，從而導致發生腎纖維化。其中與生長因子β1（growth factor-β，GF-β1）關系密切。GF-β1誘導腎間質纖維化的具體機制為GF-β1通過啟動EMT通過信號通路（Smad 為主），致使活化的肌成纖維細胞與ECM 的過度產生，同時抑制ECM 降解，使其逐漸堆積［27-28］。

2.3 EMTEMT 在進展性腎纖維化發生及發展過程中占有舉足輕重的作用［29］。在進展性腎纖維化過程中，不完全再生的腎小管上皮細胞中未成熟的間充質表型代替了原本上皮細胞表型，并逐漸轉化為腎纖維化主要病因之一的纖維細胞及肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）。MFB 過量合成大量ECM 并堆積，加快腎臟纖維化病變的進展［30］。血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）上調TGF-β的表達，最終結果可導致小管上皮細胞發生成纖維細胞活化和EMT［31］。

2.4 其他國內外研究表明腎臟間質成纖維細胞、腎小管上皮細胞、巨噬細胞等，細胞因子如IL-6、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、AngⅡ表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、TNF-α、白細胞介素3（interleukin-3，IL-3）等細胞間質均與腎纖維化關系密切［32-33］。

3 抑制腎臟纖維化

無論是復發性還是續發性蛋白尿的原發性或續發性的慢性腎病發病過程，腎小管萎縮和腎小管間質纖維化都在此病發病過程中起關鍵作用［34-36］。因此，無論是哪種性質的蛋白尿均可看做腎小球疾病嚴重程度和腎小球及腎小管間質更進一步損傷的主要因素。同時，大量的蛋白尿浸潤，在蛋白超負荷的環境下，致使近端小管的上皮細胞凋亡及誘導腎間質炎癥反應相關因子施放與補體激活，如細胞因子、趨化因子和血管活性分子。管狀細胞最終分化為肌成纖維細胞，加重原有腎間質纖維化進程，腎功能漸行性惡化［37-38］。

3.1 抑制MAPK/核轉錄因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)信號通路慢性炎癥反應引起的成纖維細胞增生及腎臟組織被刺激后致使ECM 的過度產生和超負荷積聚與腎間質纖維化的發生及進展密切相關。ECM是由纖連蛋白、膠原蛋白、層黏連蛋白等纖維蛋白和蛋白多糖組成的動態結構。國內外相關研究證實TGF-β可在抗腎間質纖維化的過程中發揮重要作用，具體機制為TGF-β信號途徑轉導至Smad 途徑及非經典途徑后，通過激活P38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK）等APK 家族信號通路抑制基質降解及上調基質蛋白合成［39-42］。此外，國外研究表明AS-IV主要以劑量依賴性方式抑制大鼠腎成纖維細胞的分化，機制可能與AS-IV可下調細胞增殖標志物增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表達及抑制TGF-β1誘導的α平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）增多，進而加強抑制TGF-β1誘導的大鼠腎成纖維細胞活性及效能的作用，同時，研究證實AS-IV可降低TGF-β1活性，進而抑制腎纖維化密切相關的腎成纖維細胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK 的活化程度及抑制TGF-β1誘導NF-κB p65亞基的核轉位［37，43］。IκBα是IκB家族中NF-κB的上游關鍵分子的主要家族成員，而NF-κB p65對調控靶基因轉錄及NF-κB 占有舉足輕重的地位［36，44-45］。以上研究表明，AS-IV 可通過調控MAPK、NF-κB 及p38MAPK 信號通路途徑阻滯ECM 過度生成及堆積和腎成纖維細胞分化及膠原蛋白、纖連蛋白、α-SMA 合成等方式在抗腎纖維化領域發揮顯著作用［19-20］。

3.2 抑制TGF-β/Smad 信號通路TGF-β受體是活化后可通過Smad 依賴性和非Smad 依賴性傳遞信號的絲氨酸/蘇氨酸激酶跨膜異型受體復合物［46-47］。其中，腎臟的纖維化與Smad 信號傳導途徑中的Smad2/3 等分子明顯升高關系密切［48］。TGF-β/Smad 信號通路被激活后，使腎纖維化過程中細胞外基質的主要來源之一腎小管上皮細胞EMT 產生過程的間充質細胞標記物α-SMA 蛋白表達增加［49-50］，因此，其濃度水平可一定程度反映腎纖維化發展的程度。此外，大量研究［22，49］已證實AS-IV 可 通 過 降低DN 小 鼠腎 組織 中TGF-β1、Smad2/3 和α-SMA 蛋白表達抑制TGF-β/Smad 信號通路，最終抑制腎臟纖維化和腎小管上皮細胞EMT。

3.3 抑制TLR4/NF-κB 途徑當腎臟受到不可忽視的破壞時，包括成纖維細胞、內皮細胞、足細胞及腎小管上皮細胞等腎臟細胞幾乎都會參與ECM的生成與腎臟修復的過程，同時，炎癥細胞包括淋巴細胞、單核/巨噬細胞等細胞均通過不同途徑參與腎纖維化的異常修復，表現為成纖維細胞增殖、炎癥細胞浸潤及ECM積累，其中NF-κB是調控促炎介質產生，促使這一系列炎癥反應發生及可用于確定炎癥反應的關鍵轉錄因子［51］。國外研究顯示AS-IV 能高效能抑制可誘導炎癥反應的前饋關鍵因子，如IL-1β、促炎介質TNF-α的活性，致使浸潤性巨噬細胞和淋巴細胞數量、炎癥細胞因子IL-1βmRNA及TNF-α水平相應減少［52］，以降低單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎纖維化模型小鼠纖連蛋白和膠原蛋白I 含量，從而遏制炎性細胞浸潤和炎癥細胞因子分泌。國外體外研究表明AS-IV 可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的人腎小管近段上皮細胞中TNF-α和IL-1βmRNA 水平［53］。TLR 家族主要成員之一TLR4（TLR是LPS的受體之一），它可通過誘導炎性細胞因子表達及激活NF-κB 致使炎癥反應發生及發展［54］。此外，相關研究通過小鼠實驗，明確表明AS-IV 抑制劑IκBβ表達抑制了UUO小鼠TLR4 受體及NF-κB 表達，上調NF-κB，與TLR4抑制劑TAK-242 高度相似［52-53］。相關實驗研究表明，AS-IV 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路減弱腎臟炎癥反應［55］。綜上所述，AS-IV 可通過TLR4/NF-κB 途徑減少腎纖維化發生或發展中伴隨的炎癥反應，達到延緩甚至改善腎纖維化進展的目的。

4 含黃芪的抗腎間質纖維化的中藥制劑及中成藥

4.1 腎康注射液腎康注射液是一種臨床上常見且有效成分主要由黃芪、大黃、丹參、紅花中提取與精制而成的中藥注射劑，現代醫學主要用于治療慢性腎衰、糖尿病腎病及腎病綜合征等腎臟領域疾病。相關研究［56-58］表明SKI具有抗纖維化、抑制TGF-β1、骨形成蛋白7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）及抗炎的作用，在降低患者血清中肌酐和尿素氮水平、延遲腎小球硬化、提高腎小球濾過率、抑制腎間質纖維化及提高腎血流量等腎臟疾病病因方面也具有顯著成效。

4.2 黃芪當歸合劑黃芪當歸合劑是一種由黃芪和當歸組成的中成藥，LI S 等［59］研究表明，黃芪當歸合劑能夠通過降低CKD 病患的血肌酐和尿素氮、提高腎小球濾過率，最終達到改善腎臟功能的目的。黃芪當歸合劑還具備抑制5/6Nx 大鼠細胞外基質的聚集、纖連蛋白（fibronectin，FN）、腎小球硬化及膠原IV（Col-IV）表達的作用，進而阻滯腎纖維化發生及發展［60］。

4.3 尿毒清顆粒尿毒清顆粒是以黃芪為主要成分用于慢性腎臟病變領域的常用中成藥物，具有抗凝、促纖溶、免疫調節的功效［61-62］，文豐等［63］通過臨床對照實驗發現常規西醫治療輔助尿毒清顆粒可通過改善鈣磷代謝及腎功能指標延緩腎纖維進程；譚菲等［64］構建糖尿病腎病SD 大鼠模型實驗，表明尿毒清顆粒能夠通過調控TGF-β1/p38MAPK，改善大鼠腎功能和減輕腎臟組織的病理損傷，具體為下調TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA，抑制TGF-β1/p38MAPK信號轉導通路等一系列內容。

4.4 腎康丸楊愛成等［65］研究表明腎康丸通過可下調DN 大鼠腎臟組織下調DN 大鼠腎臟組織中TRAIL 系統的主要的調節因子NF-κB mRNA，蛋白表達NF-κB mRNA 及蛋白表達，對大鼠的腎功能具備一定保護作用，可延緩腎纖維的進展。此外，相關研究表明，腎康丸可通過阻斷Smad2/3 信號致使End MT 進程受阻的方式最終達到抑制End MT 促腎臟纖維化的進程［66］。

4.5 黃芪三七合劑鄧小芳［67］通過構建慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）大鼠模型，認為黃芪三七合劑可延緩慢性腎纖維的進程，其中與減弱p38MAPK 蛋白表達密切相關，由此對大鼠腎臟具有保護作用。王露等［68］的研究表明黃芪三七合劑具備降低CKD 大鼠肌酐(serum creatinine，SCr)、尿 素氮(blood urea nitrogen，BUN)的作用，降低腎組織α-SMA、TGF-β1蛋白的表達，以恢復CKD 大鼠腎功能并延緩其腎纖維化進程。

4.6 黃芪丹參顆粒付旭等［69］通過大鼠研究證實黃芪丹參顆粒可在一定程度上改善大鼠的腎功能及保護腎臟組織，作用機制可能與黃芪丹參顆粒可有效降低Wnt4和β-catenin在腎組織中的表達，進而影響腎間質纖維化過程中腎小管上皮細胞轉分化以干預Wnt/β-catenin 信號通路，最終達到保護UUO 大鼠腎小管功能的目的，且存在一定量效關系。

5 結語與展望

腎纖維化病理生理機制主要為腎臟膠原蛋白合成增加、降解減少，EC大量積累［70-72］。過往研究表明，由于腎纖維化發病機制過于復雜，病勢纏綿難愈，病久必虛，病久必瘀，甚至部分患者不可避免地發展成為ESRD。黃芪甲苷在慢性腎臟疾病的治療中，尤其在抗腎纖維化進展中得到廣泛應用。因此，更多的分子機制將有待研究證實。明確黃芪甲苷抗腎纖維化產生及發展的相關靶標和途徑能夠為其在腎臟系統或其他系統疾病中的運用提供依據。另外，已有研究證實AS-IV 主要通過劑量依賴等方式阻止及防范足細胞凋亡及抑制腎臟纖維化［73-75］，因此需要學者從AS-IV其劑量和安全性問題方面作進一步探索研究。

以此為索引，深入了解腎纖維化的發生發展機制，大量基礎實驗顯示單一靶點很難發揮療效［76-80］，因此需從多方位、多環節、多靶點新型中藥復方藥物著手進行研究。研究腎纖維化，把中醫和西醫病因病機以及治療融會貫通，辨病和辨證有機結合，找到逆轉或減弱腎纖維化的科學方法指日可待。