不同月份紋黨所含總黃酮的動態積累研究?

靳貴林，邊 洋，，3，邵士俊，楊扶德

1 西藏藏醫藥大學藏醫藥基礎教育部重點實驗室，西藏 拉薩 850000；2 中國科學院蘭州化學物理研究所；3 甘肅中醫藥大學

紋黨來源于桔梗科植物素花黨參Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L.T.Shen干燥根，主產于年平均氣溫15℃、年平均降雨量445 mm，平均海拔1500～2500 m，地處西秦嶺山脈、南秦嶺山帶的甘肅文縣中寨，質量優異遠銷海外。研究發現黃酮類物質具有抗癌、抗氧化、抗炎、保肝、抗血栓形成、舒張血管、抗病毒、抗菌和抗過敏等多種藥理活性［1-2］。黃愛玲［3］研究發現黃酮類物質有降血脂、鎮痛、增強免疫力的作用。黃酮類化合物可以有效抑制興奮性神經遞質谷氨酸釋放，從而保護神經系統［4］。黃酮類化合物異甘草素通過改善腦能量代謝和抗氧化作用有效保護大腦以防腦損傷［5］。龔金炎［6］從神經遞質說、神經可塑性假說和內分泌系統功能改變方面研究發現黃酮類化合物有抗抑郁癥作用。現代研究［7-8］發現黨參黃酮類可促進大鼠小腸上皮細胞遷移。汪建紅［9］研究發現野生新疆黨參總黃酮能增強小鼠血清和肝臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，延長小鼠負重游泳時間，提高肝糖原、肌糖原儲備量，降低小鼠運動后血清尿素氮含量。可見，黃酮類化合物有重要的藥理藥效作用，而紋黨品質形成研究中黃酮類化合物的研究成為不可或缺的一部分。

1 材料

1.1 儀器超聲儀器（江蘇昆聲市超聲儀器有限公司；220v、100W，Q/320583GSFY008-2006）；紫外分光光度計（perkin Elmer lambda 35）；錐形瓶（50 mL）；容量瓶（100、50、25 mL）；燒杯（50mL、100、250、500 mL）。

1.2 藥材試劑紋黨和白條黨經甘肅中醫藥大學楊扶德教授鑒定為正品；乙醇（天津市凱通化學試劑有限公司，批號：20150706）；蘆丁（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201409）；亞硝酸鈉（上海山浦化工有限公司，批號：20110412）；氫氧化鈉（利安隆博華醫藥化學有限公司，批號：20100312）；硝酸鋁（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20150202）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備精密稱取過40 目篩60℃下干燥2 h的紋黨2.0 g置于50 mL錐形瓶中，加75%乙醇40 mL，超聲提取90 min 后過濾，濾液置于50 mL 容量瓶，用75%乙醇定容于50 mL 容量瓶，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁10 mg，置于250 mL 燒杯中加75%乙醇30 mL 超聲使蘆丁溶解，溶解液置于50 mL 容量瓶，用75%乙醇洗滌燒杯并轉移洗滌液入50 mL 容量瓶，加入75%乙醇定容，即得0.2 mg/mL蘆丁標準溶液（對照品溶液）。

2.3 標準曲線的制備精密取0.2 mg/mL蘆丁標準溶液0.5、1、2、3、4、5 mL分別置于25 mL容量瓶，各容量瓶加入1 mL 新配5%亞硝酸鈉溶液，混合均勻后靜置6 min；加入1 mL 新配10%硝酸鋁溶液，混合均勻后靜置6 min；加入10mL 新配5%氫氧化鈉溶液，搖勻后用75%乙醇定容，靜置20 min。以75%乙醇為空白組，在510 nm處測定吸光度（見表1），以體積（mg/mL）為橫坐標X，吸光度（A）為縱坐標Y軸，建立直線方程得Y=2.75908X-0.00602，r=0.9994，標準曲線見圖1。

表1 標準曲線數值

圖1 總黃酮標準曲線

2.4 精密度實驗取0.2 mg/mL蘆丁標準溶液2 mL加入到25 mL容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。結果RSD值小于2%，精密度較好。見表2。

表2 精密度考察結果

2.5 穩定性實驗3 支25 mL 容量瓶中分別精密加0.2 mg/mL 蘆丁標準溶液1 mL，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。分別于30 min及1、2、4、8、10、12 h，510 nm 處測定吸光度，通過標準曲線計算出蘆丁標準溶液中含蘆丁質量（mg）。結果表明0～10 h 內RSD=3.9，在0～2 h 內其值較穩定。見表3。

表3 穩定性考察結果

2.6 重復性實驗精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h 的紋黨2.0 g 置于50 mL 錐形瓶中，平行5次，按“1.3.1”項下制備，取供試品2 mL于25 mL容量瓶，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度，計算出供試品溶液中蘆丁質量。結果表明RSD值小于2%，重現性較好。見表4。

表4 重現性考察結果

2.7 加樣回收實驗精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h 的紋黨1.0 g 置于100 mL 錐形瓶中，平行5 次，按“1.3.1”項下方法制備后定容于50 mL容量瓶，為供試品溶液。5 個25 mL 容量瓶中分別加入供試品溶液2 mL，加入0.2 mg/mL蘆丁標準品溶液1 mL，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度，計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結果顯示平均回收率為96.06%，回收率較為穩定可靠。見表5。

表5 加樣回收考察結果

2.8 條件優化

2.8.1 條件選擇 本實驗選用2015 版《中華人民共和國藥典》槐花項下總黃酮測定方法，加入新配5%亞硝酸鈉1 mL，混合均勻后靜置6 min；加入新配10%硝酸鋁1 mL，混合均勻后靜置6 min；加入新配5%氫氧化鈉10 mL，靜置15 min，顯色。超聲提取總黃酮是一種高效簡便不破壞化學成分的提取方法［10-12］。葛亮［13］研究發現用超聲提取黃酮類化合物，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色測定總黃酮含量是一種簡便可靠易行的方法。而黃酮類化合物回流提取時有所損失故而本實驗采取超聲提取方法，由于亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色較穩定可靠因而采取該顯色方法測定總黃酮含量。

2.8.2 提取溶劑選擇 精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h的紋黨5份，每份2.0 g，1份加50 mL甲醇，1 份加75%乙醇50 mL，超聲提取90 min，平行試驗3 次，將濾液定容于50 mL 容量瓶作為供試品溶液待用。取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結果顯示甲醇提取效率更高，選擇甲醇為提取溶劑。見表6。

表6 提取溶劑考察結果

2.8.3 超聲提取時間選擇 精密稱取6份過40目篩，60℃下干燥2 h 的11 月份紋黨2.0 g 并編號，各加入75%乙醇40 mL，1 號超聲30 min、2 號超聲45 min、3號超聲60 min、4號超聲75 min、5號超聲90 min、6號超聲120 min，平行試驗3次，濾液定容于50 mL容量瓶作為供試品溶液，待用。精密量取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。計算總黃酮含量（以蘆丁計）。結果顯示超聲提取120 min含量最大，但75、90、120 min所含總黃酮含量做曲線可知90～120 min趨于平衡狀態，綜合考慮選取90 min。見表7。

表7 提取時間考察結果

2.9 供試品黃酮含量測定

2.9.1 紋黨參黃酮含量測定 精密稱取過40 目篩，60℃下干燥2 h的供試藥材各5份，每份2.00 g，加入75%乙醇40 mL，超聲提取90 min，過濾，濾液定容于50 mL 容量瓶為供試品溶液待用。精密量取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。在510 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量。見表8。

表8 紋黨總黃酮含量測定結果 mg/g

2.9.2 白條黨總黃酮含量測定 精密稱取過40目篩，60℃下干燥2 h 的白條黨各5 份，每份2.00 g，加入75%乙醇40 mL，超聲提取90 min，過濾，濾液定容于50 mL容量瓶為供試品溶液，待用。精密量取供試品溶液2 mL 置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.3”項下“加入1 mL”起，依法測定吸光度。計算總黃酮含量（以蘆丁計）。見表9。

表9 白條黨總黃酮含量測定結果 mg/g

2.10 數據分析分析不同月份采收的紋黨所含總黃酮與白條黨參所含總黃酮；紋黨在春季尚未萌發時其總黃酮含量由于尚未損耗，是全年紋黨黃酮含量的最高時期，也就是說紋黨總黃酮在大地解封之前含量高達2.937 mg/g；隨季節變遷溫度上升，5 月份紋黨開始發芽破土而出，其總黃酮含量下降到1.705 mg/g；隨著光合作用的加強和溫度上升，紋黨的生理活性在不斷增強，6月份總黃酮含量較5 月份的1.705 mg/g 上升到1.950 mg/g；7～8 月份紋黨生長最為旺盛，7 月份總黃酮含量達2.091 mg/g，8月份達2.001 mg/g；9月溫度開始下降紋黨總黃酮含量也開始下降，9 月份紋黨總黃酮含量由8月份2.001 mg/g下降到1.941 mg/g，10～11月份呈整體下降趨勢，11月紋黨總黃酮含量降到了全年最低1.575 mg/g；12月份后大地凍結紋黨采集困難。紋黨全年總黃酮含量平均值為2.002 mg/g，高于白條黨參（采收于9 月）的1.631 mg/g。從單一總黃酮含量講紋黨質量較好。紋黨總黃酮含量全年呈現先下降后上升的趨勢。見圖2。

圖2 紋黨和白條黨參總黃酮含量比較

3 小結

從紋黨生長過程看，總黃酮含量出現了先下降后上升最后下降的趨勢。紋黨總黃酮含量7、8月最高，是紋黨生長較為旺盛的季節。總黃酮含量的多少隨季節變遷而變化，春季紋黨尚未萌發時總黃酮含量最高，證明紋黨藥材“初春發芽前采收”的合理性。從黃酮含量角度分析，紋黨黃酮含量高于白條黨參，紋黨質量較白條黨好。