小麥熱激轉錄因子 TaHsfA2-5 的耐熱性分析

李明月，李孟軍，李國良，郭秀林，孟祥照*

(1 河北省農林科學院 生物技術與食品科學研究所，石家莊 050051；2 河北師范大學 生命科學學院，石家莊 050024； 3 石家莊市農林科學院，石家莊 050000)

高溫脅迫常常引起植物細胞內蛋白的錯誤折疊以及活性氧(ROS)的積累，嚴重制約著植物的正常生長發育過程[1]。通常來講，當植物周圍環境溫度升高 10～15 ℃就可形成熱脅迫[2]。為了在高溫脅迫下得以生存，植物進化出一套能夠維持蛋白穩定以及清除細胞內過量 ROS 的分子機制，即：當植物感知高溫脅迫后，熱激轉錄因子被迅速激活并結合到下游熱激蛋白(heat shock protein，Hsp)的啟動子上誘導其表達，從而抑制細胞內蛋白的錯誤折疊，保護蛋白質的構象以確保其行使正常的生物學功能；與此同時，植物細胞內的 ROS 清除功能酶被激活，以清除細胞內過量的 ROS 從而維持細胞的內穩態[3]。研究表明，熱激轉錄因子不僅是植物響應高溫脅迫的重要調節因子，同時也參與植物對于低溫、干旱以及高鹽的響應過程[4]。在擬南芥中異源過表達水稻(Oryzasativa)熱激轉錄因子OsHsfA2e能夠增強植物的耐鹽性[5]。水稻熱激轉錄因子OsHsfC1b也參與植物對于鹽脅迫的響應過程[6]。過表達TaHsfA2d的轉基因擬南芥不僅提高了植株的耐熱性，同時還增強了其耐鹽和抗旱能力[7]。

自從首個植物 Hsf 基因從番茄 (Lycopersiconesculentum)基因組中克隆得到以來，越來越多的 Hsf 基因被陸續鑒定、研究[8]。已有的研究表明，擬南芥、番茄、水稻和玉米 (Zeamays)基因組中分別有 21、16、25 和 30 個 Hsf 基因，相對于上述物種，小麥基因組中的 Hsf 多達 82 個[9-13]。依據蛋白結構將 Hsf 分成 A、B 和 C 族，到目前為止，研究最為廣泛的是 A 族中的 A1 和 A2 亞族[14]。在擬南芥中，Hsf 家族成員 HsfA1s 通過激活 HSR (heat stress responsive)基因從而增強植物的耐熱性，與此同時，這類基因的轉錄水平受到環境溫度的精細調控[15]。在正常溫度范圍內，熱激蛋白 Hsp70 和 Hsp90 能夠通過與 HsfA1 蛋白互作而阻止 HsfA1 的核定位，進而抑制 HsfA1 蛋白的活性，而當植物處于高溫脅迫下時，就會使得 HsfA1 蛋白從熱激蛋白 Hsp70 和 Hsp90 組成的復合體中解聚并穿梭進核以調控下游 HSR 基因[16-17]。

此外，周期蛋白依賴性蛋白激酶 CDC2a 能夠磷酸化 Hsf1 并隨后抑制其結合到下游基因啟動子上[18]。在擬南芥和番茄基因組中只有1個HsfA2 亞族成員，受高溫脅迫誘導表達，在植物的基礎和獲得性耐熱過程中均發揮重要作用[19-20]。在高溫脅迫過程中，熱激轉錄因子HsfA2 基因的表達受到 HsfA1 的調控，轉錄后的 HsfA2 蛋白與 HsfA1 形成異源寡聚體進核調控下游基因的表達[21]。已有的研究表明，AtHsfA2 能夠部分恢復athsfA1 突變體的表型，但在功能方面，AtHsfA2 更傾向于調控細胞內氧化還原狀態、碳水化合物、脂類代謝途徑基因的轉錄，對于維持高溫脅迫后細胞的內穩態起到關鍵作用[22-24]。將玉米 A2 亞族的3個基因ZmHsf01、ZmHsf04 和ZmHsf05 異源過表達在擬南芥中，均顯著地提高了轉基因擬南芥的基礎耐熱性[25-27]。在對小麥 A2 亞族基因TaHsfA2d的研究過程中發現，異源過表達該基因后不僅提高了轉基因擬南芥的耐熱能力，同時還促進了種子的產量[7]。

相對于擬南芥等物種，對于小麥熱激轉錄因子的研究起步晚，許多基因的功能還有待于挖掘。本實驗室前期的研究結果表明，小麥基因組中存在 82 個 Hsf，它們隨機分布在 21 條染色體上，其中 A2 亞族有18個成員，充分說明了小麥 Hsf 的復雜性[13]。在前期研究的基礎上，本研究從小麥中克隆得到TaHsfA2-5 基因的完整編碼序列，以期為進一步揭示TaHsfA2-5 基因的生物學功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料及培養本研究選取小麥半冬性耐熱性小麥品種‘滄 6005’為材料(種子由河北省滄州市農業科學院惠贈)。選取籽粒飽滿且大小均一的小麥種子，經由 0.1% HgCl2表面消毒后，用自來水清洗干凈并置于室溫下浸泡 12 h，待根長長至 1～2 cm 時，移栽到 Hoagland 營養液中，置于溫度為 25 ℃、相對濕度為 50%～60%、光周期為 16 h/8 h (光照/黑暗)、光照強度為 70～100 μmol·m-2·s-1的培養室生長。

本研究使用的擬南芥野生型材料為Columbia(Col-0)生態型，由本實驗室繁種后保存。選取適量擬南芥種子，經由 0.5% 的 NaClO 進行表面消毒后，以無菌水清洗 5～6 次，并均勻地鋪在 MS 固體培養基上，低溫春化 3 d 后置于室溫下萌發。

1.2 小麥熱脅迫處理選取正常生長于 Hoagland 營養液中的小麥幼苗，參照李慧聰等[28]的方法進行高溫脅迫處理，分別剪取小麥的葉片、莖和根，于液氮中速凍后備用。另外，在常規種植大田試驗中，分別取花期的雌蕊、雄蕊、萼片，以及 1 周齡幼胚和成熟胚，液氮速凍，用于組織表達分析。

1.3 目的基因的克隆以RNArose Reagent Systems試劑盒 (華舜生物工程公司，上海)提取植物總RNA后，按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒 (TaKaRa，大連) 提供的方法去除基因組DNA并反轉錄合成cDNA第一條鏈。以基因特異性引物 (F: 5′-GACATGGACCCGGTGCCGAGTC-3′; R: 5′-TGGAATGGAA-CTAGGTTGAGAGGGT-3′)對上述cDNA進行 PCR 擴增，產物回收純化后連接至T載體 (pEasy-Blunt Simple Cloning Kit，TransGen Biotech)，經菌液 PCR 檢測后選取 3 個陽性單克隆送至上海生工生物工程技術有限公司進行測序。

1.4 亞細胞定位分析將TaHsfA2-5 基因的編碼區以XbaⅠ 和BamHI 雙酶切體系構建在含有 CaMV35S 啟動子的 pJIT1-hGFP 表達載體上，可以將 TaHsfA2-5 蛋白與 GFP 進行融合表達。實驗參照李慧聰等[28]描述的方法進行， 質粒經過金粉包埋后通過基因槍將其瞬時轉化到洋蔥表皮細胞中，在室溫下暗培養 16 h后，于激光共聚焦顯微鏡 (Zeiss META510)下觀察熒光。

1.5 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR) 參考 Duan 等[13]對小麥 Hsfs 的分析結果，設計TaHsfA2-5 的特異引物，以TaRP15 (表 1)作為內參基因，按照張玉杰等[29]描述的反應體系以及程序進行擴增。在組織表達模式中將根的表達量設定為 1，在熱脅迫過程中將取材 0 min 的表達量設定為 1，每次實驗設定 3 個生物學重復，每個生物學重復設定 3 次技術重復。數據以 Excel 進行分析并計算標準誤差，同時結合 SPSS 19.0 軟件分析差異顯著性。

表1 小麥 TaHsfA2-5 基因的擴增以及擬南芥 HSRs定量分析引物序列

1.6 擬南芥的遺傳轉化及耐熱性分析擬南芥遺傳轉化及其篩選過程均參考張玉杰等[29]的方法。將獲得的目的基因TaHsfA2-5 利用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后構建到 pCAMBIA1300 載體上，測序驗證正確后提取質粒并轉化農桿菌。利用蘸花法轉化擬南芥野生型植株，篩選陽性苗直至獲得純合株系。選取其中的line 15_8、 line 14_32 和 line 4_3 株系用于耐熱性分析。耐熱性分析分為基礎耐熱性 (45 ℃處理1 h 后，置于 22 ℃下恢復 8 d)和獲得耐熱性 (37 ℃處理 1 h，22 ℃培養 2 d，46 ℃處理 50 min 后，置于 22 ℃下恢復 8 d)兩部分，每次實驗每個株系至少處理 30 棵幼苗，共進行 3 次獨立實驗。分別觀察耐熱處理前后的幼苗生長表型，記錄并拍照，隨后收集不同株系的地上蓮座葉，測定葉綠素含量。

1.7 熱脅迫后轉基因擬南芥 HSR 基因的表達分析選取 6 個擬南芥熱相關蛋白，取 5 d 齡擬南芥野生型和轉基因系 Line 15_8，經基礎和獲得耐熱性熱處理后，于恢復 1 h 和 4 h 分別取樣進行定量分析。以 0 h 不同處理的野生型作為對照，數值記為 1。引物序列見表 1。

2 結果與分析

2.1 小麥 TaHsfA2-5編碼蛋白的序列及其亞細胞定位分析

參照 Duan 等[13]對小麥 Hsf 的分析結果，從熱處理后的小麥品種‘滄 6005’ 二葉一心幼苗葉片中克隆得到熱激轉錄因子TaHsfA2-5 的完整編碼序列，共計 1 218 bp，編碼 405 個氨基酸(圖1)。經蛋白序列相似性比對分析發現，該基因編碼的蛋白序列與大麥 HvHsfA2b 蛋白的相似性最高，達 88.07%(圖2)。

為進一步分析 TaHsfA2-5 蛋白的亞細胞定位情況，構建了可以融合表達 GFP 的瞬時表達載體，通過基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光，實驗結果表明，TaHsfA2-5 蛋白定位于細胞核(圖3)。

2.2 小麥 TaHsfA2-5 的組織表達以及在熱脅迫下的誘導情況

qRT-PCR分析表明，TaHsfA2-5在小麥多個組織器官中均有表達，并且在成熟的根、雄蕊、雌蕊、萼片、成熟種子以及幼胚中呈現出較高的表達水平，在幼嫩的根、莖、葉以及成熟的莖、葉中呈現較低的表達水平(圖4)。

在熱脅迫條件下，TaHsfA2-5 基因在小麥葉片和根部受誘導表達的程度不同。其中，小麥葉片中的TaHsfA2-5 基因更易受到熱脅迫誘導而上調表達，并且在熱處理 90 min 時達到最大值；而根中TaHsfA2-5 基因在熱脅迫處理條件下表現出較弱的上調表達趨勢，且在熱處理 120 min 時達到最大值 (圖5)。

2.3 小麥 TaHsfA2-5 基因在擬南芥中的耐熱性分析

擬南芥 HsfA2 亞族中只有一個成員，屬于熱誘導型轉錄激活因子，在熱激響應過程中會受到 AtHsfA1 家族成員的調控，并在擬南芥獲得性耐熱過程中發揮重要作用[20]。為進一步分析TaHsfA2-5 是否參與調控耐熱過程，選取 line 15_8、 line 14_32 和 line 4_3 過表達擬南芥純合株系，進行基礎性耐熱性(圖6，A、B)和獲得性耐熱性鑒定實驗(圖6，C、D)。結果表明，在正常生長條件下，轉基因株系與野生型的生長狀況一致；在基礎性和獲得性耐熱試驗處理條件下，轉基因株系相較于野生型擬南芥幼苗能夠保持更好的生長狀況，說明TaHsfA2-5 能夠增強擬南芥植株的基礎性和獲得性耐熱性。

同時，通過對熱脅迫處理前后擬南芥地上蓮座葉中葉綠素含量的測定分析 (圖6，E)發現，在處理前，轉基因株系蓮座葉中葉綠素含量與野生型無明顯差異，通過基礎性和獲得性耐熱試驗處理后，轉基因株系和野生型蓮座葉中葉綠素的含量均降低，但轉基因株系蓮座葉中葉綠素含量要明顯高于野生型，以上結果進一步說明TaHsfA2-5 基因參與了調控植物的基礎性以及獲得性耐熱過程。

2.4 異源表達小麥 TaHsfA2-5 對擬南芥熱激響應基因的影響

植物中的熱激轉錄因子會通過結合下游 HSR 基因啟動子區一段保守的熱激響應元件(GAAnnTTCnn GAA)來調控植物對于高溫脅迫的響應[22]。

為進一步分析小麥TaHsfA2-5 對轉基因擬南芥熱激響應基因的影響，對擬南芥轉基因材料 line15_8 和野生型(WT)進行了基礎性和獲得性耐熱的處理，取樣后檢測了 6 個下游 HSR 基因的表達量。實驗結果表明，無論是通過基礎性還是獲得性耐熱的處理，異源過表達TaHsfA2-5 均能夠不同程度地上調所檢測的 HSR 基因的表達量，但在獲得性耐熱處理的情況下多數 HSR 基因的上調表達幅度明顯小于基礎性耐熱處理(圖7)。

3 討 論

植物響應高溫脅迫是一個十分復雜的過程，涉及到多種信號通路、調控網絡以及細胞組分，其中熱激轉錄因子在調控植物響應高溫脅迫的過程中發揮著重要作用[30]。以往的研究結果主要是來自于模式植物擬南芥和番茄，隨著測序技術的發展，越來越多作物中的熱激轉錄因子被發現。已有的研究表明，AtHsfA2是擬南芥 A2 亞族的唯一成員，且是響應高溫脅迫的關鍵調控因子[22-24]。普通小麥是同源六倍體物種，基因組龐大，重復序列多，Xue 等[31]在 2014 年推測小麥至少有 56 個熱激轉錄因子，單單 HsfA2 亞族就有 9 個成員。本實驗室的研究發現，小麥的熱激轉錄因子多達 82 個，同時 HsfA2 亞族也比先前預測的多，我們共發現 18 個 HsfA2 亞族成員，且初步分析發現多數 HsfA2 亞族成員會受到高溫脅迫、過氧化氫、脫落酸、水楊酸以及 PEG 的誘導[13]。相較于模式植物，小麥中 HsfA2 亞族成員的復雜性不言而喻，因此對于小麥 HsfA2 亞族成員生物學功能的解析將會極大地推動耐熱性小麥的育種進程。本研究從熱處理后的小麥二葉一芯幼苗葉片中克隆得到熱激轉錄因子TaHsfA2-5 的完整編碼序列，并分析了相應蛋白序列以及亞細胞定位情況，證明該基因具備HsfA2 亞族的結構特征和定位特點，暗示其作為熱激轉錄因子具備調控下游熱激響應基因表達的可能。

根據熱激轉錄因子蛋白結構域 HR-A 與 HR-B 之間氨基酸的數量將 Hsf 劃分為 A、B、C 三大類，在 A 族中 HR-A 與 HR-B 結構域之間的氨基酸數量最多，達到 21 個，其次是 C 族，有 7 個氨基酸的插入，而 B 族中沒有氨基酸的插入[32]。蛋白結構的不同也決定了各族轉錄因子會行使不同的功能。當前的研究結果表明，A 族成員在調控植物響應基礎耐熱性以及獲得耐熱性的過程中發揮著主效作用，在高溫脅迫的誘導下能夠通過結合下游熱激響應基因啟動子上的熱激元件(HSE，heat shock element)從而使得植物對于周圍不利環境做出快速應答，其中 A1 亞族在花粉中的表達量較高，A2 亞族屬于高溫脅迫誘導型轉錄因子，可以在擬南芥中保持較高的表達水平[14, 23-24]。B 族和 C 族的研究報道較少，由于它們并不具有 AHA 基序，暗示這些熱激轉錄因子并不具有激活功能[30]。很多 B 族成員也都可以受到高溫脅迫的誘導，但更多的是在熱響應后期發揮著負調控基因表達的作用，而 C 族成員在高溫脅迫下普遍下調，通常高表達于小麥的籽粒以及根中[31, 33-34]。本研究結果顯示，TaHsfA2-5 的表達在多個小麥組織中均可檢測到，并且在成熟的根、雄蕊、雌蕊、萼片、成熟種子以及幼胚中呈現出較高的表達水平；同時，該基因的表達會受到高溫脅迫的誘導而上調表達，與之前對于 HsfA2 亞族的描述一致。

目前的研究結果表明，不同家族的 Hsf 存在蛋白結構和生物功能的差異，即便是同一亞族的 Hsf 成員之間也行使著不一樣的功能。在擬南芥中異源表達TaHsfA2e基因雖說均可提高轉基因材料的基礎耐熱性和獲得耐熱性，但顯然過表達TaHsfA2e基因更利于提高植物的基礎耐熱能力，然而，同家族的另一個成員TaHsfA2f基因更利于提高植物的獲得耐熱能力[29,35]。在本研究中，將TaHsfA2-5 基因轉化野生型擬南芥，通過基礎以及獲得性耐熱實驗發現，無論是從表型方面觀察，還是對于熱脅迫后地上蓮座葉中葉綠素含量的測定，均說明TaHsfA2-5 基因對于轉基因擬南芥的基礎以及獲得性耐熱能力具有不同程度的提高，但在基礎性耐熱過程中，轉基因擬南芥表現出相較于野生型更強的耐熱性，同時，多數熱激蛋白的表達量也呈現出更高的表達水平。至于TaHsfA2-5 如何在不同的耐熱性處理下發揮不一樣的調控方式，可能與其在不同生物學過程中調控的下游基因有關。如本研究結果表明，轉基因擬南芥中熱激蛋白HSP70b在基礎性耐熱過程中上調明顯，而在獲得性耐熱過程中，基本上未受到高溫脅迫的誘導。