非小細胞肺癌患者血清DJ-1、sMICA水平與臨床病理特征及預后的關系研究*

孔彥，田亮

（滄州市中心醫院1.檢驗科，2.病理科，河北 滄州061001）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌類型的75%～80%，盡管NSCLC治療技術不斷提高，但是病死率仍然較高，位居惡性腫瘤首位，尤其是晚期肺癌，5年生存率不到5%[1]。探討與NSCLC 預后相關的生物學標志物有助于指導臨床治療，提高肺癌患者生存率。DJ-1 蛋白是一種高度保守的可溶性蛋白，參與多種細胞通路，同時DJ-1 作為一種癌基因，在腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用[2]。腫瘤惡性進展的關鍵之一是腫瘤細胞獲得逃避免疫介導而使腫瘤細胞殺傷作用減弱[3]，MHC-I 類鏈相關蛋白A（MICA）是NK 細胞、T 細胞表面的跨膜糖蛋白，主要發揮應激作用下的免疫應答[4]。可溶性MHC-I 類鏈相關蛋白A（sMICA）由MICA 脫落而成，當惡性腫瘤發生時，可在外周血清檢測到sMICA 水平升高[5]。目前DJ-1、sMICA 與NSCLC 的相關報道十分少見，DJ-1、sMICA與NSCLC 預后關系尚不清楚，本研究檢測NSCLC 患者血清DJ-1、sMICA 水平，探討其與NSCLC 患者臨床病理特征、預后的關系，旨在為臨床治療、預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年1月—2017年1月滄州市中心醫院收治的77 例NSCLC 患者為NSCLC 組。其中，男性51例，女性26例；年齡51～72歲，平均（63.35±4.21）歲；吸煙史53例；腫瘤直徑≥3 cm 41例，＜3 cm 36 例；病理類型：腺癌45 例，鱗癌32 例；分化程度：低中分化46 例，高分化31 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期35 例，Ⅲ、Ⅳ期42 例；淋巴轉移23 例，遠處轉移19 例。另選取同期本院50 例體檢健康者為對照組。其中，男性38例，女性12 例；年齡50～71 歲，平均（63.01±4.15）歲；吸煙史19 例。納入標準：①支氣管鏡或空芯針肺穿刺活檢病理學證實為NSCLC；②初次診斷NSCLC；③臨床病理資料完整，配合隨訪者。排除標準：①經病理證實為其他類型肺癌；②入組前已經接受手術、化療、放療等治療；③合并其他部位原發惡性腫瘤；④合并肺結核、嚴重肝腎功能不全。NSCLC 組年齡、性別與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；NSCLC 組吸煙史與對照組比較，差異有統計學意義（χ2=11.737，P=0.001），NSCLC 組高于對照組。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

NSCLC 患者入組后24～72 h 采集靜脈血5 mL，對照組于體檢當日采集，置于TG16-Ⅱ臺式高速離心機（湖南平凡科技有限公司）4℃3 000 r/min 離心20 min（離心半徑10 cm），取血清保存于-70℃低溫冰箱（美國Thermo 公司），48 h 內完成待檢。取出樣本后，4℃緩慢復融，采用RT6000 酶標儀（深圳霄杜生命科學有限公司），應用酶鏈免疫吸附試驗檢測血清DJ-1、sMICA 水平，試劑盒購自上海博華生物試劑公司。上述檢驗均由本院檢驗中心完成，試劑批內變異控制在6.0%以內。

1.3 隨訪

所有NSCLC 患者均定期隨訪至2020年1月，每3 個月隨訪1 次，隨訪以門診復查、電話或微信形式進行。以腫瘤復發、轉移、死亡為預后不良，統計隨訪期間患者無疾病進展生存（progression-free survival, PFS）和總體生存（overall survival, OS）情況。PFS 定義為自病理確診至腫瘤復發、轉移、死亡的時間。OS 定義為自病理確診至各種原因引起的死亡的時間。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗；影響因素的分析采用Cox 回歸模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清DJ-1、sMICA水平比較

兩組血清sMICA、DJ-1 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），NSCLC 組高于對照組。見表1。

表1 兩組血清DJ-1、sMICA水平比較 （±s）

表1 兩組血清DJ-1、sMICA水平比較 （±s）

組別n DJ-1/（ng/mL）sMICA/（pg/mL）NSCLC組對照組t 值P 值77 50 18.24±3.19 4.12±1.03 36.054 0.000 146.35±22.16 31.26±7.05 42.390 0.000

2.2 血清DJ-1、sMICA 水平與NSCLC 患者臨床病理特征的關系

不同臨床病理特征NSCLC 患者血清DJ-1、sMICA 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），低中度分化、有淋巴轉移、有遠處轉移患者血清DJ-1 水平均高于高度分化、無淋巴轉移、無遠處轉移患者；TNM 分期Ⅲ和Ⅳ期、低中度分化、有淋巴轉移患者血清sMICA 水平均高于TNM 分期Ⅰ和Ⅱ期、高度分化、無淋巴轉移患者。見表2。

表2 不同臨床病理特征NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平的比較 （±s）

表2 不同臨床病理特征NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平的比較 （±s）

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2.3 不同血清DJ-1、sMICA 水平NSCLC 患者的預后

建立NSCLC 患者Kaplan-Meier 生存分析模型，根據DJ-1、sMICA 均值將NSCLC 患者分為高DJ-1水平組36 例（DJ-1≥18.24 ng/mL），低DJ-1 水平組41 例（DJ-1 ＜18.24 ng/mL）、高sMICA 水平組43 例（sMICA ≥146.35 pg/mL）、低sMICA 水平組34 例（sMICA ＜146.35 pg/mL）。Kaplan-Meier 生存曲線見圖1、2。經Log rank χ2檢驗，高DJ-1 水平組NSCLC患者PFS 生存率、OS 生存率分別為52.78%（19/36）、58.33%（21/36），低于低DJ-1 水平組的92.68%（38/41）、95.12%（39/41）（χ2=7.346 和6.348，P=0.007 和0.012），高sMICA 水平組NSCLC 患者PFS 生存率、OS生存率分別為60.47%（26/43）、65.12%（28/43），低于低sMICA 水平組的91.18%（31/34）、94.12%（32/34）（χ2=7.433 和6.297，P=0.006 和0.012）。

圖1 不同血清DJ-1水平NSCLC患者PFS、OS生存曲線圖

2.4 NSCLC患者預后影響因素的Cox回歸分析

以NSCLC 患者預后不良（0 =否，1 =是，t =生存期）為因變量，納入年齡（1 ≤60 歲，2 ≥60 歲）、性別（1=女，2=男）、吸煙史（1=無，2=有）、腫瘤直徑（1 ≤3 cm，2 ≥3 cm）、病理類型（1=腺癌，2=鱗癌）、分化程度（1=高度分化，2=低中度分化）、TNM 分期（1=Ⅰ、Ⅱ期，2=Ⅲ、Ⅳ期）、淋巴轉移（1 =否，2 =是）、遠處轉移（1=否，2 =是）、sMICA（1 ≤146.35 pg/mL，2 ≥146.35 pg/mL）、DJ-1（1 ≤18.24 ng/mL，2 ≥18.24 ng/mL）為自變量，納入多因素Cox回歸模型（逐步后退法，α入=0.05，α出=0.10），結果顯示：淋巴結轉移（=1.697，95% CI：1.421，1.953）、分化程度（=1.344，95% CI：1.194，1.648）、DJ-1 水平（=1.831，95% CI：1.652，2.354）和sMICA 水平（=2.164，95%CI：2.012，3.956）是NSCLC 患者預后不良的影響因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響NSCLC患者預后的多因素Cox回歸分析參數

圖2 不同血清sMICA水平NSCLC患者PFS、OS生存曲線圖

3 討論

NSCLC 是最常見的肺癌類型，我國2014年新發肺癌病例78.1 萬，死亡62.6 萬，居男性腫瘤發病率和病死率首位，居女性腫瘤發病率第二位、病死率第一位[6]。NSCLC 早期診斷率低，確診患者多數已處于中晚期，約50%患者生存狀況較差[7]。腫瘤細胞分化程度、侵襲、遷移等惡性生物學行為是導致治療失敗、腫瘤復發、患者死亡的重要因素。識別NSCLC與臨床病理特征及預后的相關機制可為臨床分子靶向治療提供新的靶點，為預后評估提供準確的信息，進而加強干預，達到改善預后目的。因此尋找預測NSCLC患者預后的非侵入性指標十分重要。

DJ-1 屬絲裂原依賴性癌基因，位于染色體1p36.2-p36.3，分子量約20 kD，參與機體RNA 結合、信號轉導、氧化應激、細胞凋亡、腫瘤生成過程[8]。現有研究顯示DJ-1 在直腸癌[9]、甲狀腺乳頭狀癌[10]、膠質母細胞瘤[11]等多種惡性腫瘤表達升高，且與腫瘤侵襲、轉移有關。DJ-1 是否能成為NSCLC 預后預測的潛在生物學指標尚不確定，本研究發現NSCLC 組血清DJ-1 水平高于對照組，DJ-1 在低中度分化、有淋巴結轉移、有遠處轉移患者中水平明顯高于高度分化、無淋巴轉移、無遠處轉移患者，說明DJ-1 與NSCLC 惡性程度有關，參與NSCLC 侵襲、轉移過程。BAI 等[12]報告DJ-1 表達與NSCLC 淋巴轉移顯著相關，也驗證了DJ-1 參與NSCLC 轉移的過程。從Kaplan-Meier 生存曲線可以看出高水平DJ-1 患者PFS、OS 生存率偏低，Cox 回歸分析高水平DJ-1 與NSCLC 預后不良有關，經進一步校正混雜因素，DJ-1仍與NSCLC 不良預后有關，提示DJ-1 水平升高可能促進NSCLC 高度侵襲和轉移，導致不良預后的發生，DJ-1 可能成為NSCLC 侵襲、轉移的潛在指標，為臨床預后評估提供有效信息，并為NSCLC 分子靶向治療提供新的思路和方向。DJ-1 參與NSCLC 不良預后的機制：Jun 氨基末端激酶（JNK）通過B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）-Beclin1 復合物介導自噬反應，抑制腫瘤細胞生長，DJ-1 通過JNK 依賴途徑改變自噬，調控Beclin1 參與的自噬反應，DJ-1 過表達抑制JNK 和Bcl2 磷酸化，進而阻止Beclin1 和Bcl2 解離，促使腫瘤細胞增殖[13]。其次，DJ-1 通過張力蛋白同源的基因（PTEN）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路參與癌細胞的增殖、遷移和侵襲，下調DJ-1 表達，腫瘤細胞G0/G1 期細胞數量增加，S 期細胞數量減少[14]。DJ-1 過表達可通過上調P-糖蛋白（P-gp）與凋亡蛋白Bcl-2 的表達，促進藥物主動外泄，導致化療耐藥，增強腫瘤細胞的抗凋亡能力[15]，最終導致疾病進展和不良預后發生。

MICA 是NK 和CD8 T 淋巴細胞表面激活受體——自然殺傷細胞2 族成員D（NKG2D）的配體，由MHC 基因編碼，分子量43 kD，表達于胸腺、胃腸道及腫瘤細胞表面，主要發揮免疫應答作用。當腫瘤發生時MICA 通過與NKG2D 配體特異性結合傳遞活化信號，誘導以NK 細胞為主的免疫應答，清除腫瘤細胞，發揮免疫監視作用[16]。sMICA 是MICA 的可溶性形式，是MICA 脫落形成的游離狀態，MICA 脫落降低了MICA 水平，影響NKG2D 識別，進而誘導T 細胞表面和NK 細胞表面NKG2D 內化、降解，影響NK 細胞的免疫監測，促進腫瘤細胞免疫逃逸[17]，在腫瘤免疫效應中發揮與MICA 相反的作用。有研究顯示sMICA在食管癌組織中過度表達，與TNM 分期、分化程度、化療療效均存在密切關系[18]，乳腺癌患者血清sMICA水平明顯升高，sMICA 水平與臨床分期、淋巴結轉移均有關[19]。目前sMICA與NSCLC患者預后的關系尚不確定，本研究發現NSCLC患者血清sMICA水平也明顯升高，sMICA水平與NSCLC患者分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關，說明sMICA參與NSCLC侵襲、轉移病理機制。生存分析和回歸分析結果證實高水平sMICA與NSCLC患者預后不良有關，sMICA可以作為NSCLC預后評估的一個參考指標。sMICA參與NSCLC不良預后的機制可能為：腫瘤低氧微環境介導sMICA表達上調，通過阻斷NKG2D 通路來抑制NK 細胞對腫瘤細胞殺傷性，導致腫瘤免疫逃逸，促使腫瘤增殖、侵襲及轉移[20]。楊斌等[21]報道顯示隨著肺癌患者血清sMICA 水平升高，NKG2D+CD8+NKT 細胞含量減少，sMICA 抑制NKG2D+CD8+NKT 功能活性，sMICA、NKG2D+CD8+NKT細胞共同作用下誘導腫瘤免疫逃逸過程。以上結果提示sMICA 異常升高可能是NSCLC 腫瘤細胞逃避NKG2D 介導免疫監視的機制之一，抑制MICA 脫落可能下調sMICA水平，激活NK細胞為主的免疫效應，達到清除腫瘤細胞的目的。

綜上所述，NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平均升高，高水平DJ-1、sMICA與NSCLC患者不良預后有密切關聯。DJ-1、sMICA可能為NSCLC患者預后評估提供參考，并為NSCLC治療提供新的靶點。