2019—2021 年我國29 個省級行政區雞傳染性支氣管炎流行病學調查

李 彬，韓曉青，劉紅祥，宋姍姍，于 靜，范慶增，張宇龍，譚 鵬，杜元釗，劉 東

（青島易邦生物工程有限公司，動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東青島 266032）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，給我國以及世界養禽業帶來了巨大損失[1]。小日齡雛雞感染IBV 后多表現“支堵”呼吸道或“腎腫”，成年產蛋雞多表現“假母雞綜合征”和產蛋量下降。IBV 基因型眾多，且容易變異和重組，在不同地區和不同品種間引起的發病率差異較大[2]，因此系統了解IBV 在我國的流行特點以及不同基因型的流行規律，對防控該病具有十分重要的意義。

為了解我國雞群的IBV 感染情況，2019 年1月—2021 年l0 月，從山東、河南、遼寧等29 個省級行政區收集疑似IBV 感染樣品，采用RT-PCR方法篩選陽性樣本，并對背景信息明確的陽性樣本進行時間、空間、群間的統計分析，總結2019—2021 年IBV 不同基因型的流行特點和規律，以期為我國IB 防控提供參考。

1 材料

1.1 檢測樣品

2019 年1 月—2021 年l0 月，從山東、河南、遼寧等29 個省（自治區、直轄市）采集臨床疑似感染IBV 的白羽雞、黃羽雞、蛋雞、肉種雞的氣管、腎臟、盲腸扁桃體等組織病料以及咽喉/泄殖腔棉拭子樣品共38 442 份。

1.2 試劑

RT-PCR 試劑（一步法試劑盒）和Maker，為Takara 公司產品；50×TAE buffer，為上海生工公司產品；Goldview 核酸染料，為Labest 公司產品；瓊脂糖，為康為世紀公司產品；核酸提取純化試劑盒，為杭州博日科技有限公司產品。

1.3 儀器與設備

超凈工作臺，DL-CJ-INDII，北京東聯哈爾儀器制造有限公司產品；離心機，TD24-WS，Eppendorf 公司產品；核酸提取純化儀，NPA-32P，杭州博日科技有限公司產品；電泳儀，DYY-6C，北京六一生物科技有限公司產品；凝膠成像儀，JS-2000，上海培清科技有限公司產品；移液器，Eppendorf 公司產品。

2 方法

2.1 病料RNA 提取

取氣管、腎臟等組織病料約2 g，加入4～5 mL滅菌PBS 或者生理鹽水，置研磨器（滅菌）中研磨或者用剪刀細心剪碎，置-20 ℃中反復凍融3 次，離心取上清備用。在棉拭子樣本中加入PBS 緩沖液500 μL，離心取上清備用。

取上述病料或棉拭子樣品上清約200 μL 置1.5 mL 離心管中，加入500～600 μL TRIzol 劇烈振搖30 s 后，靜置5 min，再次劇烈振搖30 s 后，靜置5 min；加入200 μL 氯仿，上下顛倒混勻30 s，靜置5 min，4 ℃ 12 000g離心15 min；離心完畢后，取上清400～500 μL（注意不要吸到中間層白色物質）放入新的滅菌離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒數次后（不可劇烈震動）靜置10 min，4 ℃ 12 000g離心10 min；倒掉異丙醇，加入1 mL 75%乙醇（DEPC 水配制），振搖，將白色沉淀懸浮，4 ℃ 7 500g離心5 min；棄去上清，將干燥沉淀物（將離心管倒置于衛生紙或者其他吸水紙上，室溫約5 min 即可）加入20 μL DEPC 水溶解，用于RT-PCR 檢測，或-20 ℃保存備用；采用全自動核酸提取試劑盒提取RNA。

2.2 RT-PCR 檢測

根據NCBI 上發表的IBV 核酸全序列，設計擴增S1基因的特異性引物（表1），用于樣品檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成。RTPCR 反應條件（一步法試劑盒）：50 ℃ 30 min，95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共32 個循環；72 ℃延伸5 min。將RT-PCR 擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像儀觀察并記錄結果[3]。

表1 引物序列和擴增目的片段大小

2.3 S1 基因測序及分析

將RT-PCR 產物電泳后，對目的條帶進行膠回收，回收產物與pMD18-T 載體連接，連接產物轉化至DH5α 感受態細胞，然后將其涂在氨芐板上，置于37 ℃溫箱內培養過夜；挑取單個白色菌落，接種到含有氨芐的LB 液體培養基，37 ℃搖床培養8 h 以上；對菌液進行RT-PCR 檢測，將陽性菌液送至生工基因公司進行測序。將測序結果拼接，采用MegAlign 程序將檢測序列與NCBI 中發表的已知序列（表2）進行比對后進行基因型鑒定。

表2 IBV 參考序列

3 結果與分析

3.1 RT-PCR 檢測

3.1.1 總體情況 利用RT-PCR 方法，在采集的38 442 份疑似樣品中，檢出6 436 份IBV 陽性樣品，陽性檢出率為16.7%，對其中2 983 份陽性樣本進行了S1基因測序分型（表3）。

表3 2019—2021 年IBV 疑似感染樣品總體檢測結果

3.1.2 時間分布 由表3 可以看出，2019—2021 年，IBV 陽性檢出率分別為12.5%、16.4%、21.0%，呈逐年增長趨勢。按月份統計結果（表4）顯示：1—12 月份均有陽性樣品被檢出，陽性檢出率呈現一定的季節性變化特征，7—9 月份檢出率（11.3%～15.4%）較低，3—6 月（17.3%～19.3%）和10—12 月（17.5%～19.0%）檢出率較高。

表4 2019—2021 年各月IBV 檢測情況統計

3.1.3 地區分布 按照送檢地區統計結果（表5）顯示：全國29 個省級行政區中有27 個檢出陽性樣品，表明IBV 的全國分布范圍較廣，且呈現一定的區域分布特征，東部和中部的家禽養殖密集區，如山東（19.5%）、河北（18.2%）、江蘇（16.7%）、吉林（18.7%）、福建（23.7%）、甘肅（19.9%）、重慶（21.8%）等地區陽性檢出率較高，西部和北部地區如內蒙古（3.6%）、新疆（2.0%）等地區陽性檢出率較低。

表5 2019—2021 年不同地區IBV 檢測情況統計

3.1.4 禽群分布

3.1.4.1 不同品種 不同品種統計結果（表6）顯示，IBV 檢出率存在一定的品種差異，白羽肉雞陽性檢出率最高（28.9%），肉種雞最低（5.0%）。

表6 2019—2021 年不同品種檢測情況統計

3.1.4.2 不同周齡 不同周齡統計結果顯示，各周齡階段均有IBV 感染，但0～6 周齡階段感染最為普遍和嚴重（表7），其中蛋雞感染高峰為1～3周齡，而白羽肉雞為2～6 周齡（表8）。

表7 2021 年1—10 月各周齡階段IBV 陽性樣本統計

表8 2021 年1—10 月各周齡雞群IBV 陽性樣本統計

3.2 S1 基因測序及分析

從6 436 份陽性IBV 樣品中選取2 983 份進行測序，然后用Meg Align 軟件進行序列比對，剔除774 份已知疫苗株，將2 209 份IBV 野毒樣本進行分型，按照年份、品種、周齡進行統計。

3.2.1 基因型分布 統計結果（表9）顯示：陽性樣本中共檢出5 種基因型，其中QX 型占比最高（66.5%），GVI 型次之（27.7%），這兩種為當前主要流行優勢基因型。

表9 2019—2021 年IBV 基因型分類統計

3.2.2 不同基因型時間分布 統計結果（表10）顯示，2019 年QX 型占比最高，達到72.4%，GVI型為19.6%。2021 年QX 占比仍然最高，但占比有所下降，為66.4%，而GVI 型的占比卻由19.6%提升至28.7%。從近3 年的趨勢來看，QX 型呈下降趨勢，GVI 型有升高趨勢。

表10 2019—2021 年各IBV 基因型分類統計

3.2.3 不同基因型品種分布 統計結果（表11）顯示，白羽肉雞群中以QX 型和GVI 型為主，而其他雞群中流行的基因型較為復雜，其中蛋雞以QX、GVI、LDL 型為主，黃羽雞以QX 型、GVI 型、TW1 型、重組型為主，肉種雞以GVI 型、QX 型、重組型、LDL 型為主。

表11 IBV 基因型在不同品種的分類統計

3.2.4 不同基因型（QX 和GVI）周齡分布 統計結果（表12）顯示，QX 型小日齡即可感染，0～3 周齡檢出占比為33.2%；GVI 型在＞3～6 周齡檢出較多，占66.4%。6 周齡以后QX 型和GVI 型檢出占比均較低。

表12 IBV 主要基因型（QX、GVI）的周齡分布統計

4 討論

自1930 年首次在美國北達科他州發現 IB 以來，幾乎所有養雞國家均發現有該病流行。我國于1978 年由鄺榮祿首次報道在廣東省分離到IBV。IBV 流行的基因型眾多，且隨著時間推移呈現復雜化趨勢[4-5]。

本研究對我國29 個省級行政區疑似IBV 樣品進行病原檢測，結果發現IBV 感染普遍，且呈加重趨勢。目前疫苗免疫仍然是控制IB 最常用、最有效的措施。目前常用的IBV 活疫苗有Mass 型（H120、H52、Ma5、w93、28/86）以 及4/91、LDL、QX 型等，其中Mass 型+4/91 型的組合已在國外眾多國家使用，被認為對多種血清型的IBV毒株均能提供交叉保護。但近年來加拿大、美國等國家也開始出現“假母雞”發病的報道，說明IB的現場流行情況比較復雜，對其防控面臨更多的壓力和挑戰。

國內目前采取H120+4/91 或H120+LDT3 或H120+QX 等多種組合免疫方式，免疫效果良好。但大量的流行病學監測結果顯示，國內流行的 IBV毒株正處于持續不斷進化中[6-8]。參考文獻[9]的IBV 分類方法，從本次檢測測序的基因型來看，QX 型（66.5%）、GVI 型（27.7%）占比較高，且GVI 型流行有上升趨勢，值得關注和警惕。當前針對GVI 型的同源活疫苗還沒有商業疫苗上市，因此對該基因型疫苗的研發應提上日程。針對IBV滅活疫苗，有學者認為其免疫后主要產生體液免疫IgG 為主，對IB 感染的引起的呼吸道類臨床表現保護效果較差，但對于內臟型如腎型或生殖型臨床保護良好。此外IBV 滅活疫苗還具有安全性好、可快速應對變異株等優點，可作為防控IB 的重要措施。此外，近年來從部分大型養殖企業的現場試用情況來看，保護效果超過預期。

IBV 致病與日齡具有相關性，感染日齡越小，危害越大。小日齡時，免疫系統尚不健全，一旦早期感染，可通過與α-2,3 唾液酸受體[10-11]結合，對呼吸道如氣管、肺臟等上皮細胞損傷較大，引起氣管纖毛大量脫落和炎性物質滲出，導致“支氣管堵塞”現象。同時，部分基因型毒株如QX 型、TW型、GVI 型等經呼吸道感染后，可從單核細胞的病毒血癥現象擴散至輸卵管、腎臟、腸道等部位，引起“生殖型”“腎型”“腺胃型”等不同的發病現象[1，10，12]。從本次研究結果來看，QX 型初次感染高峰時間大多在3 周齡以內，而GVI 型初次感染高峰時間大多在3～6 周齡階段，品種以肉種雞占比最高。關于不同基因型的日齡差異原因，目前尚不明確。分析認為可能與不同IBV 毒株的生物學特性或母源抗體等因素有關。針對小日齡感染IBV的防控，一方面要加強生物安全，避免早期感染，對孵化室、育雛舍等進行定期的凈場消毒；另一方面要減少飼養批次，避免不同日齡雞群混養帶來的帶雞傳播。此外，還要對種雞進行優勢流行毒株如QX 型、GVI 型的針對性免疫，降低種雞的帶毒排毒概率，同時給下一代雛雞提供高水平的母源抗體，降低生殖型IB 患病風險。

5 結論

研究發現：我國IBV 流行范圍較大，發病率較高，且呈加重趨勢；流行基因型復雜，但以QX型和GVI 型為主；冬春或秋冬季節多發，小日齡雞群感染嚴重，發病危害較大。因此，我國的IB防控面臨較大壓力與挑戰，需要加強優勢基因型疫苗的研發，重點做好小日齡雞群的IB 防控。