寧夏雞傳染性支氣管炎病原學檢測及N 基因序列分析

閔 澤，周海寧，馬 龍，尹 才，馬 林，魏凡華，李知新

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏回族自治區動物疾病預防控制中心，寧夏銀川 750011）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。IB 在世界廣泛流行，是導致養禽業經濟損失的重要病因之一[1]。IBV 最初只導致感染雞群出現呼吸道癥狀，隨著病情發展，將侵害蛋雞的生殖系統，致使蛋質量下降。其中，腎型IB 主要侵害雛雞的腎臟，引起腎臟病變，導致雛雞死亡[2]。我國從1977 年開始對該病進行研究，各地區相繼分離出了IBV 毒株。IBV 流行毒株基因型復雜[3]，主要為QX、4/91、TW、Mass 型，其中QX型是優勢基因型[4]。

IBV 基因組全長約27.6 kb，核酸為單股正鏈RNA，編碼4 種結構蛋白，分別為核蛋白（N）、纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）及小膜蛋白（E）。N 蛋白上存在抗原決定簇，具有免疫識別位點，是IBV 重要的免疫原，對機體產生體液免疫發揮著關鍵作用[5]。同時N 蛋白編碼基因是IBV 基因組中的保守結構域，不易發生突變，在病毒復制、轉錄時處于關鍵位置[6]，但其突變會改變保護性。因此，分析分離株的N 蛋白編碼基因，有助于了解病毒在當地的流行趨勢和遺傳演化規律。

近年來，寧夏報告了多起IB 疫情，嚴重影響了當地養禽業發展。為摸清IB 流行狀況和IBV 優勢基因型，采集雞咽喉/泄殖腔拭子開展了研究，以期為寧夏IB 疫情防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2021 年9—11 月，在寧夏利通區、中寧縣、沙坡頭區、惠農區、大武口區、隆德縣、原州區、西吉縣等8 個縣（區）的8 個規模化養殖場和3 個散養戶，按不同飼養場舍劃分采樣群體，每個場舍采集日齡相同的蛋雞咽喉/泄殖腔拭子共646 份，-80 ℃保存。

1.1.2 主要儀器 核酸提取儀，B24NP968-S 型，西安天隆公司產品；紫外凝膠成像儀，univeral hood II，美國伯樂公司產品；基因擴增儀，PCT200 型，美國伯樂公司產品；電泳儀，DYY-2C 型，電泳槽，DYYCP-31C 型，均為北京六一生物科技有限公司產品；高速冷凍離心機，5424型，德國艾本德公司產品。

1.1.3 主要試劑 磁珠法病毒RNA 提取試劑盒，購自西安天隆公司；DL 2 000 DNA Maker和PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus），均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司（TaKaRa）；SPF 雞胚，購自山東浩泰畜禽養殖基地。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離培養 將樣品置于預先加入含有青霉素（10 000 U/mL）及鏈霉素（10 000 μg/mL）的1 mL PBS 緩沖液的離心管中，振蕩2 min，8 000 r/min 離心2 min，取上清液收集到離心管中；將已孵育9～10 d 的SPF 雞胚，用碘伏和酒精依次消毒后，鉆孔接種病毒，72 h 后收集全部尿囊液，用含有10 000 U/mL 的青霉素和10 000 μg/mL 鏈霉素的PBS 緩沖液稀釋5～10 倍，按此方法盲傳3～5 代。

1.2.2 引物合成 根據文獻[7]設計合成一對引物，預期片段大小為409 bp。引物序列見表1。

表1 參考引物序列

1.2.3 RT-PCR 檢測 選擇盲傳至第4 代的明顯出現矮小化等典型IB 癥狀的雞胚，收集尿囊液，按照GB/T 23197—2008 中的方法，將尿囊液稀釋后作為待檢材料。使用磁珠法病毒RNA 提取試劑盒進行核酸提取。反應體系：PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0 μL、2×One Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL、模板 1.0 μL、Forward primer 1.0 μL、Reverse primer 1.0 μL、RNaseFree H2O 8.5 μL，反應總體積25.0 μL。擴增產物用1%凝膠電泳進行鑒定。將電泳條帶約為409 bp 大小的擴增產物送至華大基因公司進行測序。

RT-PCR 擴增參考程序：50 ℃ 30 min，94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，50.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物4 ℃待檢。

1.3 分離毒株序列分析

分離株N基因測序后，與NCBI 數據庫中29株我國和其他國家早期分離的IBV 毒株N基因序列進行比對，利用MEGA7.0 軟件繪制系統發育進化樹。主要參考毒株見表2。

表2 參考毒株序列

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測

646 份雞咽喉/泄殖腔拭子，經RT-PCR 擴增和電泳，發現88 份樣品呈現單一清晰條帶，大小約409 bp，與預期條帶相符，確定為IBV 陽性，總陽性率為13.62%。部分樣品檢測結果見圖1。

不同地區和養殖類型統計結果（表3）顯示：西吉縣陽性率最高，為36.00%，其次是利通區，陽性率為32.29%，其他縣區陽性率較低；規模化養殖場陽性率普遍高于散養戶。

表3 寧夏8 個縣（區）雞咽喉/泄殖腔拭子樣品檢測結果

2.2 N 基因遺傳進化分析

本試驗成功分離到1 株IBV 毒株（NXIBV）。遺傳進化分析結果（圖2）顯示，除Ark99 株較為獨立外，分離株與其他參考毒株形成了3組進化群，處于第Ⅲ進化群（QX 型），與我國山東SDIB702/2012 株、SDIB778/2012 株及SDIB662/2011 株的親緣關系最近，同源性分別為97.55%、97.29%、97.28%，與韓國K047-12 株同源性為97.01%；與我國優勢毒株QX 型代表株（KM586818）同源性較高，為93.31%，與TW、4/91、TC07-2 等的同源性為85.60%～89.67%；與我國常用的疫苗血清型H120（AY028296）、M41（DQ834384）毒株同源性分別為86.67%和86.14%。

3 討論

IB 嚴重威脅著我國養雞業。臨床中，腎型IB最為常見[8]，導致的雛雞死亡率可達30%以上，剖檢可見腎臟出現大量尿酸鹽沉積，伴隨出血，呈花斑狀[9]。本試驗對部分癥狀明顯的病死雞進行病理解剖，發現與腎型IB 病變較為一致。本次試驗發現，70 日齡左右的蛋雞陽性率最高，說明IBV更易感染較小日齡蛋雞。

董志華等[10]報道，2009—2017 年廣西IB 平均陽性率為11.5%；丘旭龍等[11]報道，河南省2010—2011 年IB 最高陽性率為15%。江蘇、山東、四川等省份在2008—2020 年進行過IB 流行病學調查，發現該病一年四季均可發生，但在秋季和冬季檢出率較高，發病率為11%～15%[10-16]。本試驗發現，寧夏地區蛋雞群的IBV 總體陽性率為13.62%，與國內其他省份近十年狀況基本相同。

基因分析結果表明，本試驗分離株與29 株參考毒株的N基因序列形成了3 個較大的分支，而分離毒株處于第Ⅲ分支（QX 型），與SDIB702/2012株親緣關系最近，同源性為97.55%，與我國QX代表株P100 同源性為93.31%。此外，該分離株與韓國SNU-11045 株、SNU-8065 株親緣關系較近，而這兩株毒株均為2005 年分離的QX 腎型毒株[17]。因此，可以確定本試驗分離株為我國優勢基因型QX 型。廣西、山西、山東、江蘇等地在2008—2020 年多次對分離出的本地毒株進行基因分析，結果發現本地流行毒株70%以上為QX型[10-11，13-14]，說明在寧夏流行的優勢IBV 基因型與我國其他多個省份流行的優勢基因型相同。目前我國常使用的疫苗血清型有H120、H52 及H41 型，都屬于Mass 基因型[18]。Mass 型是我國目前運用最廣泛、效果最好的疫苗基因型，但與寧夏分離株同源性較低，由此推測我國常用的Mass 型疫苗對本試驗分離株難以產生有效的免疫保護作用，這可能是導致疫情發生的主要原因。

綜上建議：繼續進行IBV 流行病學監測，對外來引進雞群要做好引種檢疫工作，防止外來病原入侵；在此病高發的秋冬季節，更要重視對該病的防控；針對本地疫情流行狀況，及時使用高效疫苗進行預防，從而減少養雞戶經濟損失。

致謝：

本研究得到了寧夏動物疾病預防控制中心王曉亮研究員和南京農業大學在讀博士生程肖曄、左冉坤的幫助。