新疆和田鵝源沙門氏菌血清型鑒定及耐藥性分析

鄭佳玉，肖海俠，程雪梅，艾柯代·吐魯洪，李鑌罡，張 毅，佟盼盼，蘇戰(zhàn)強

（新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052）

沙門氏菌血清型繁多，分布廣泛，是重要的人獸共患病的病原體[1]，可引起動物的腸炎、菌血癥和腸外感染等急性或慢性疾病，嚴重時還會導致患病動物死亡[2-3]。沙門氏菌可以導致2～3 周齡的雛鵝大批死亡，致死率可達15%以上，嚴重時可達80%[4]。沙門氏菌不僅對幼鵝有重大危害，還會對鵝蛋的孵化造成嚴重影響，可經種鵝生殖道垂直傳播至鵝蛋中，導致許多雛鵝在孵化過程中就感染死亡，而攜帶沙門氏菌的鵝胚即使在孵化過程中存活，也會在出殼后幾天內死去，成活率極低[5]。沙門氏菌抗原由菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（莢膜或包膜抗原）組成，依據這3 種抗原的組成不同，可將沙門氏菌分為不同的血清型[6]。截至2018 年，沙門氏菌已被確認有血清型2 610種[7]。在沙門氏菌血清型中，鼠傷寒沙門氏菌致病性較強，禽類感染后的發(fā)病率及死亡率最高[8]。在全球范圍內，最常見的血清型是腸炎沙門氏菌，其次為鼠傷寒沙門氏菌。在發(fā)達國家中，流行的血清型以鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌這兩種血清型為主。對英格蘭和威爾士的禽類進行沙門氏菌感染情況調查發(fā)現，鼠傷寒沙門氏菌感染率在禽類中位居第一，其次是雞白痢傷寒和腸炎沙門氏菌[9]。我國2006—2012 年分離的323 株禽源沙門氏菌以雞白痢、鼠傷寒和腸炎沙門氏菌為主要流行血清型，其中在鵝源沙門氏菌中占比較高的依次為鼠傷寒（11/66）、腸炎（10/66）、印第安納（10/66）和波茨坦（10/66）血清型[10]。2010—2015 年調查發(fā)現，新疆地區(qū)也以腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為主要血清型[11]。

2018 年以來，新疆和田地區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展迅速，但雛鵝的成活率一直非常低，初步懷疑是沙門氏菌導致的。目前關于新疆和田地區(qū)鵝源沙門氏菌的報道極少，因而該地區(qū)鵝源沙門氏菌流行血清型及其耐藥情況并不十分清楚。為了解新疆和田地區(qū)鵝源沙門氏菌血清型的分布特點及其耐藥性，采集兩個規(guī)模化養(yǎng)鵝場的病死鵝樣本進行沙門氏菌分離、血清型鑒定和耐藥性分析，以期為和田地區(qū)鵝沙門氏菌病防控以及指導臨床科學用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2021 年4 月，于新疆和田地區(qū)兩個規(guī)模化養(yǎng)殖鵝場，無菌采集不同日齡病死鵝內臟及肛拭子樣本，放置于含有緩沖蛋白胨水（BPW）肉湯的4 mL EP 管中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。

1.1.2 主要試劑及儀器 BPW、RVS 肉湯、HE（Hektoen Enteric）瓊脂、SS 瓊脂、TTB 培養(yǎng)基，均購自青島海博生物科技有限公司；XLT4 瓊脂和配套試劑27%十四烷基磺酸鈉溶液，購自北京陸橋技術股份有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏染色劑，購自珠海貝索生物技術有限公司；PCR 反應相關試劑（2×TaqPCR Green Mix、ddH2O），購自北京全式金生物技術有限公司。TS-2102C 恒溫搖床，購自上海天呈實驗儀器制造有限公司；SWCJ-2F 雙人雙面垂直潔凈工作臺，購自上海博訊實業(yè)有限公司；GSX1 梯度PCR 擴增儀，購自美國Eppendorf 公司；DYY-6C 電泳儀，購自北京市六一儀器廠；DYY-7C 型電泳儀，購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統，購自美國Bio-Rad 公司；高溫高壓滅菌鍋，型號HVE-50。

1.1.3 引物合成 參照文獻[12]設計沙門氏菌invA靶基因引物、多重血清型引物以及鼠傷寒型（TMP1、TMP2、TMP3）、霍亂型（CMP1、CMP2、CMP3）、嬰兒型（IMP1、IMP2、IMP3）、哈達爾型（HMP1、HMP2、HMP3）、腸炎型（EMP1、EMP2、EMP3）、都柏林型（DMP1、DMP2、DMP3）和雞傷寒型（GMP1、GMP2、GMP3）引物，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列信息詳見表1。

表1 引物序列信息

1.1.4 藥敏片 18 種藥敏片，購自杭州濱和微生物試劑有限責任公司，詳細信息見表2。

表2 藥敏片信息

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及細菌培養(yǎng) 參照GB 47894—2016[13]沙門氏菌檢測方法，從預增菌的BPW 中吸取300 μL 菌液接種于3 mL RVS 增菌液中，42 ℃恒溫搖床120 r/min 培養(yǎng)24 h；將RVS 培養(yǎng)物平板劃線接種HE 和SS 瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分離菌株生化試驗 在HE、SS 瓊脂平板上，挑選每個樣本區(qū)域中疑似沙門氏菌的單菌落置于RVS 肉湯中培養(yǎng)24 h，然后取20 μL 菌液接種于沙門氏菌成套生化鑒定管中，再挑取樣本對應的單菌落穿刺于衛(wèi)矛醇半固體中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄試驗結果。

1.2.3 沙門氏菌PCR 鑒定 采用水煮法提取菌落DNA。挑取符合沙門氏菌生化鑒定結果的RVS 肉湯，將1 mL 菌液置于1.5 mL 離心管中，12 000 r/min離心3 min，棄上清液；加入1 mL無菌緩沖液，混勻，12 000 r/min 離心3 min，棄上清液（重復2 次）；加入200 μL 無菌Buffer 混勻后放入100 ℃的水浴中，12 000 r/min，離心1 min，收集并保存上清液作為PCR 模板。以疑似沙門氏菌的DNA 為模板，利用PCR 法擴增沙門氏菌特異性invA基因；以沙門氏菌XJ-e7 菌株作為標準陽性對照，空白肉湯為陰性對照，檢測DNA 樣本中是否攜帶invA目的基因片段。PCR 總反應體系為12.5 μL。PCR 運行參數[12]：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR 擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，通過凝膠成像分析系統觀察并記錄結果。

1.2.4 血清學檢測 采用文獻[12]報道的方法，對7 種臨床常見沙門氏菌血清型進行鑒別，參照該文獻中的PCR 反應體系，擴增沙門氏菌陽性樣本。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將擴增產物在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳2 h，通過凝膠成像分析系統觀察并記錄結果。

1.2.5 耐藥性檢測 采用CLSI 推薦的K-B 法，對分離到的沙門氏菌菌株進行常規(guī)的18 種抗菌藥物敏感性檢測。挑取純化的單菌落2～3 個，接種于MH 肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h；調整菌懸液至0.5 麥氏濁度，用滅菌棉簽蘸取菌懸液，均勻且緊密地涂布在MH 平板上，室溫下放置5 min，藥敏片接觸平板后不得移動；將MH 平板置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h 后，用標尺測量并記錄抑菌圈直徑，根據CLSI（2016年版）標準，評價敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。對3 種及以上抗菌藥物同時耐藥的菌株被確定為多重耐藥菌。

2 結果

2.1 沙門氏菌分離鑒定

培養(yǎng)基分離結果（圖1）、生化鑒定結果（圖2）和PCR 驗證結果（圖3）顯示，在兩個鵝場樣本中共分離到14 株沙門氏菌，分離率為1.81%（14/773）。A 場：死亡鵝內臟樣品的沙門氏菌分離率為1.33%（4/300），肛拭子的沙門氏菌分離率為1.66%（5/300），存活病鵝肛拭子中未分離出沙門氏菌，鵝樣本中的沙門氏菌總分離率為1.44%（9/625）。B 場：病死鵝內臟樣品的沙門氏菌分離率為20.00%（4/20），肛拭子中未分離出沙門氏菌，存活病鵝肛拭子中的沙門氏菌分離率為0.91%（1/109），鵝樣本中的沙門氏菌總分離率為3.37%（5/148）。

2.2 沙門氏菌血清型

以分離到的14 株沙門氏菌DNA 為模版，經PCR 檢測和16S rRNA 基因序列分析比對，鑒定其血清型。結果（圖4～5）顯示：有11 株沙門氏菌血清型鑒定成功，共包含4 種血清型，其中鼠傷寒沙門氏菌占42.86%（6/14），腸炎沙門氏菌占21.43%（3/14），德比沙門氏菌（登錄號YSJHNRTA016）占7.14%（1/14），紐蘭沙門氏菌（登錄號YSJSGXWF013）占7.14%（1/14）；剩余3株沙門氏菌，經上述方法未能鑒定成功，無法辨別其血清型。在分離到的14 株沙門氏菌中，A 場鼠傷寒沙門氏菌占11.1%（1/9），腸炎沙門氏菌占33.3%（3/9），德比沙門氏菌占11.1%（1/9），紐蘭沙門氏菌占11.1%（1/9）；B 場沙門氏菌血清型均為鼠傷寒沙門氏菌（5/5）。

2.3 沙門氏菌耐藥性

選取10 株沙門氏菌分離株進行耐藥性檢測發(fā)現，10 株沙門氏菌均表現為對3 種及以上抗菌藥物同時耐藥（圖6），且全部對氨芐西林和鏈霉素耐藥。耐藥種數為13～15 種的沙門氏菌有5 株，占比為50%（5/10）；對10 種抗菌藥物同時耐藥的有2 株，占比為20%（2/10）；對3 種抗菌藥物同時耐藥的有1 株，占比為10%（1/10）；對4 種抗菌藥物同時耐藥的有2 株，占比為20%。

沙門氏菌分離株對18 種藥物呈現不同的耐藥性（圖7），其中對多黏菌素B 和哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率為10%，對阿莫西林-棒酸和頭孢吡肟的耐藥率均為20%，對頭孢他啶的耐藥率為40%，對氨芐西林-舒巴坦的耐藥率為50%，對頭孢噻肟、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、磺胺甲基異惡唑和氯霉素的耐藥率為60%～70%，對氨芐西林和鏈霉素的耐藥率均為100%。結果表明，沙門氏菌分離株對多黏菌素B、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-棒酸和頭孢吡肟這4 種抗菌藥物較為敏感，而對其他10 種抗菌藥物均表現為耐藥，其中對氨芐西林和鏈霉素全部耐藥。

3 討論

不同國家或地區(qū)以及不同飼養(yǎng)管理模式下的沙門氏菌分離率存在著明顯差異。2017 年的一項研究[6]表明，鵝、鴨等水禽是沙門氏菌感染率較高的動物之一。2006—2012 年我國12 個省7 個地區(qū)鵝中的沙門氏菌檢出率為12.4%，是被檢家禽種類中沙門氏菌分離率最高的[14]。2013 年歐盟報告的鵝源沙門氏菌分離率為8.4%[15]，波蘭東南部鵝群中的沙門氏菌分離率為5%[16]。本研究發(fā)現，和田地區(qū)鵝場沙門氏菌分離率（1.81%）高于德克薩斯州水禽分離率（0.5%），但低于安徽省（14%）、山東省（26%）和江蘇省（11%）[6，17]，表明新疆和田地區(qū)兩鵝場與其他地區(qū)相比感染情況并不嚴重，與新疆地區(qū)近5 年研究報道的沙門氏菌陽性率（1%～11%）[18-20]較為一致。

由于不同地區(qū)的環(huán)境氣候或者飼養(yǎng)管理存在差異等，各地區(qū)的沙門氏菌血清型流行情況也不同。本研究對兩鵝場分離出的沙門氏菌進行血清型鑒定，結果發(fā)現鼠傷寒沙門氏菌（42.86%）為優(yōu)勢血清型，其次為腸炎沙門氏菌（21.43%），與我國監(jiān)測的散發(fā)性沙門氏菌感染中的常見血清型基本一致[21]。四川省鴨源鼠傷寒沙門氏菌占37.5%，腸炎型沙門氏菌占14.6%[22]，與本研究結果較為相似；華東地區(qū)報道的禽類沙門氏菌優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門氏菌[23]，與本研究結果有所不同。根據不同鵝場的樣本分析，A 場中腸炎沙門氏菌為優(yōu)勢血清型（33.3%），與美國（FoodNet）2013—2016 年公布的食源性沙門氏菌優(yōu)勢血清型基本一致[24]。A 場中流行的沙門氏菌血清型種類較多，共有4種。而B 場血清型種類單一，均為鼠傷寒沙門氏菌（100%），與我國新疆地區(qū)2010—2015 年發(fā)布的主要流行沙門氏菌血清型和歐洲報道的沙門氏菌優(yōu)勢血清型基本一致[25]。兩鵝場分離到的沙門氏菌優(yōu)勢血清型種類差異較為明顯。本次調查發(fā)現，A 場還存在德比沙門氏菌及紐蘭沙門氏菌這兩種血清型。因此，加強鵝場沙門氏菌監(jiān)測和流行病學調查，對于沙門氏菌病預防和診治有十分重要的意義。

臨床上抗菌藥物的廣泛使用是沙門氏菌對多種抗菌藥物產生耐藥性的重要原因。不同地區(qū)，即使同種抗生素也存在一定的耐藥性差異。2019 年江蘇省沙門氏菌藥敏結果顯示，沙門氏菌對氨芐西林和磺胺異惡唑耐藥率（42.5%）最高[26]；2017年安徽省鵝場沙門氏菌藥敏檢測結果顯示，沙門氏菌對氨芐西林和鏈霉素耐藥[27]，與本試驗的耐藥情況基本一致。本研究中，沙門氏菌分離株對多黏菌素B、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-棒酸和頭孢吡肟較為敏感，耐藥率（10%～20%）較低，與遼寧省鵝源沙門氏菌對多黏菌素B 的敏感率[28]較為相似，但其他抗菌藥物的藥物敏感度與本研究結果有所差異。新疆地區(qū)報道的雞源沙門氏菌對環(huán)丙沙星的耐藥率（83.8%）最高[29]，與本研究的環(huán)丙沙星耐藥率（60%）有明顯差異。四川、河南、廣西、廣東和江西5 個地區(qū)對動物源沙門氏菌進行了β-內酰胺酶類藥敏試驗[30]，發(fā)現分離的沙門氏菌菌株對第1 代頭孢類藥物頭孢唑啉、第3 代頭孢類藥物頭孢噻呋具有嚴重的耐藥性，同時對氨芐西林、阿莫西林、氨曲南等藥物也有耐藥性，而第2代頭孢類藥物頭孢西丁、第3 代頭孢類藥物頭孢曲松、第4 代頭孢類藥物頭孢吡肟，對其有著較強的抑制作用，與本研究的沙門氏菌分離株對β-內酰胺酶類藥物中的氨芐西林、氨曲南、頭孢噻肟等的耐藥情況基本一致。

總體來說，本研究中的沙門氏菌菌株對氨基糖苷類藥物、喹諾酮類藥物、青霉素類藥物、磺胺類藥物、四環(huán)素類藥物以及氯霉素藥物均具有耐藥性，對部分β-內酰胺酶類抗菌藥物以及多黏菌素B 敏感性較高。耐藥性的產生因素有很多，比如藥物使用情況、菌體自身情況以及所攜帶耐藥基因種類等[31]。鵝場常用的抗生素藥物為頭孢噻呋和頭孢喹肟，均屬于β-內酰胺酶類抗生素中的第3代頭孢類藥物，與本研究中耐藥率較高的氨芐西林、頭孢噻肟和氯霉素同屬于β-內酰胺酶類藥物，其中頭孢噻肟與頭孢喹肟和頭孢噻呋同屬于第3 代頭孢類藥物，說明鵝場使用的藥物對鵝場沙門氏菌菌株的耐藥性產生了影響，導致鵝場沙門氏菌菌株的耐藥情況較為嚴峻。因此，在臨床上使用抗生素類藥物時，要根據鵝場日常的用藥情況進行具體分析。

4 結論

研究發(fā)現：新疆和田地區(qū)鵝源沙門氏菌流行的血清型較為復雜，其中鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢血清型，但不同養(yǎng)殖場流行的血清型種類及優(yōu)勢血清型存在差異；流行的鵝源沙門氏菌耐藥較為普遍，且均為多重耐藥。因此，需要根據各場具體的流行血清型菌株情況，科學指導臨床中的抗菌藥物使用。