豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及其主要抗原蛋白的原核表達

姜 偉，郭明佳，吳樹康，金彩虹

（龍口市動物疫病預防控制中心，山東龍口 265701）

關鍵字：多殺性巴氏桿菌；分離鑒定；抗原蛋白；克??；原核表達

豬出血性敗血癥，又稱“豬肺疫”，是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）引起的一種以敗血癥和高度呼吸困難等為主要特征的烈性傳染病。該病無年齡和季節特異性，所有年齡段的豬均易發病，一年四季均可發生，且常見于氣溫驟變等外界環境發生突變時，每年對全球養豬業造成巨大經濟損失。Pm 是一種條件致病菌，在全球范圍內廣泛分布，常寄生于宿主咽喉等部位，可以感染包括家畜、家禽、野生動物及人類在內的多種宿主[1-3]。根據特異性莢膜（K）差異，Pm 可分為A、B、D、E 和F 5 種血清型，其中引起豬巴氏桿菌病的主要為B 莢膜型菌株。

Pm 含有外膜蛋白（Omps）、菌毒素（Toxin）、鐵代謝相關蛋白（IROMPs）、裂解酶（AspA）和三聚體自轉運蛋白（TAAs）等多種免疫原性蛋白。研究[4-6]表明，體外表達這些蛋白制備的亞單位疫苗均可給宿主提供部分免疫保護力。目前關于豬源Pm Omps 相關研究較多，而關于AspA 和TAAs 免疫原性情況則缺少相關報道，且對主要抗原蛋白免疫原性的系統比較也仍需研究。

本試驗成功分離了一株豬源Pm，并以其基因組為模板成功克隆了5 個主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA），隨后利用原核表達系統成功表達了5 個重組抗原蛋白，為相關蛋白免疫原性研究及系統比較奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

營養肉湯（HB0108）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（HB4114）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（HB0177）、細菌生化鑒定管，購自青島海博生物科技有限公司；細菌全基因組DNA 提取試劑盒（D1800）、質粒小量提取試劑盒（D1100），購自北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker（3427A）、DH5α 感受態細胞（9057）、pMD18-T（6011）、BL21（DE3）感受態細胞（9126），購自寶生物工程（大連）有限公司；IPTG（GF101）、EasyTaqDNA Polymerase（AP111），購自北京全式金生物技術有限公司；ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit（C115-01），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody（CW0286）、Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated（CW0102）、eECL Western blot Kit（CW0049），購自北京康為世紀生物科技股份有限公司。

1.2 病原分離與鑒定

1.2.1 病原分離與純化培養 2021 年3 月，龍口市動物疫病預防控制中心收到該市某養豬場送檢的發病死亡病料，根據其臨床癥狀初步判斷為疑似巴氏桿菌感染。采集發病死亡仔豬的肝臟和脾臟進行觸片檢測，經革蘭氏和瑞氏染色并鏡檢；將采集的肝臟和脾臟等組織無菌接種于營養肉湯和胰蛋白胨大豆肉湯培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h，無菌挑取培養物采用“四線三區”法接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養18～24 h，進行分離純化。

1.2.2 生化鑒定 挑取可疑菌菇接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養基，37 ℃恒溫培養18 h，然后根據說明書無菌接種于細菌生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養24 h，最后將結果與伯杰氏手冊進行比對。

1.2.3 PCR 鑒定 依據Pm 特異性基因Kmt序列，設計1 對特異性鑒定引物（P1/P2，表1）并送至上海生工生物工程有限公司合成。以分離株基因組為模板，采用P1、P2 引物進行PCR 擴增，將PCR 產物進行電泳回收后連接pMD-18T 載體，連接產物轉化至DH5α 感受態細胞并涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基，37 ℃恒溫培養16 h 后挑取單個菌落送至上海生工生物工程有限公司測序，并將測序結果在NCBI 上進行Blast 比對。

表1 PCR 鑒定所用引物信息

1.2.4Kmt基因遺傳進化分析 從NCBI GenBank數據庫中隨機下載國內外已分離測序的PmKmt基因序列，使用DNAstar 及Mega 5.0 軟件[7]對分離株及參考菌株Kmt基因序列進行同源性分析，并采用maxmium likelihood 方法構建發育進化樹。參考序列詳情見表2。

表2 參考菌株Kmt 基因序列信息

1.3 主要抗原蛋白基因克隆與原核表達

1.3.1 引物設計與合成 參考GenBank 中菌株Pm 8-6 全基因組序列（登錄號CP040918），使用Primer 5.0 軟件設計針對Pm 5 個主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA）的上下游引物，并在引物兩端加入針對表達載體的特異性同源臂，引物序列具體信息見表3。

表3 構建重組質粒所用引物信息

1.3.2 pCold-I 重組質粒構建 利用1.3.1 中設計的各基因擴增引物，以分離株全基因組為模板，PCR 擴增獲得各基因目的產物；同時使用BamHⅠ和KpnⅠ限制性內切酶對原核表達載體pCold-I 質粒進行雙酶切，將PCR 產物和雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳并回收目的大小位置條帶；使用ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit 同源重組試劑盒連接線性化的pCold-I 質粒與帶有同源臂的基因片段，連接產物轉化至DH5α 感受態細胞后涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基，37 ℃恒溫培養16 h；挑取單個菌落并鑒定，將陽性樣品送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3.3 主要抗原蛋白基因原核表達與鑒定 使用質粒提取試劑盒，提取測序結果正確樣品的重組質粒，將陽性質粒轉化至BL21（DE3）感受態細胞后涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養基，37 ℃恒溫培養16 h；挑取單個菌落并擴大培養，按體積比1:1 000 比例取10 μL 菌液接種于10 mL 含有氨芐青霉素的LB 液體培養基，37 ℃培養至菌液OD450nm為0.4～0.5，加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 16 ℃低溫誘導培養24 h；將培養物4 000 r/min離心15 min，棄上清后加入1 mL PBS 重懸，取40 μL 重懸后樣品加入10 μL 蛋白上樣緩沖液，變性煮樣后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，以His-Tag 單克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗，對樣品進行Western blot 檢測。

2 結果

2.1 病原分離及鑒定

2.1.1 分離菌形態及培養特性觀察 采集發病死亡仔豬臟器進行觸片染色后鏡檢。革蘭氏染色可見大量呈革蘭氏陰性的大小不一的球桿菌（圖1）；瑞氏染色結果顯示，兩極呈明顯濃染，符合巴氏桿菌的染色特性。將無菌采集的臟器接種于營養肉湯培養基和胰蛋白胨大豆肉湯培養基，可見該分離菌在營養肉湯中生長貧瘠而在胰蛋白胨大豆肉湯中生長旺盛。在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基中，分離菌形成大小一致，帶有淡藍色光澤的濕潤、圓形露珠樣小菌落，將分離純化所得菌株命名為LK01。

2.1.2 分離菌生化鑒定 根據說明書對各生化結果進行判定，并與伯杰氏手冊進行比對。生化結果具體見表4，初步判定本次分離的病原菌為豬源Pm。

表4 分離菌株LK01 生化特性鑒定結果

2.1.3 PCR 鑒定 Pm 特異性基因Kmt的PCR 擴增結果（圖2）顯示，本次分離菌株可擴增得到大小約347 bp 的特異性片段，而陰性對照未擴增出相應片段。PCR 產物經回收后連接載體送至生物公司測序，將測序結果在NCBI 上進行在線Blast比對，發現分離菌株與其他PmKmt基因核苷酸同源性最高可達100%，因此確定本次分離菌株LK01 為豬源Pm。

2.1.4Kmt基因核苷酸序列遺傳進化分析 從GenBank 數據庫中下載已公布的14 個國內外Pm代表株序列，使用DNA star 和Mega 5.0 軟件對LK01 株及其他Pm 毒株Kmt基因進行核苷酸同源性分析并構建系統進化樹。結果（圖3）顯示，所有毒株共被分為兩個大分支，且這兩個分支的分類與分離菌株分離的時間、地區、宿主動物無明顯相關性。本次分離菌株LK01 與CQ2、EGY45 和P2-09-12-15Lb 株的親緣關系最近，其中CQ2 為國內牛源分離株。

2.2 主要抗原蛋白基因克隆與原核表達

2.2.1 主要抗原蛋白基因克隆及重組質粒構建以分離菌株LK01 全基因組DNA 為模板，對OmpA、OmpH、AspA、pIpE和TAA5 個主要抗原蛋白基因進行PCR 擴增，并對PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果（圖4）顯示，分別在819、582、1 419、1 017 和1 236 bp 處有與預期大小相符的特異性擴增條帶。將PCR 產物回收后，采用同源重組方式與雙酶切回收后的pCold-I 原核表達載體連接，將連接產物轉化至DH5α 感受態細胞后挑取單個菌落送至生物公司測序。測序結果在線Blast 比對顯示，擴增片段均為Pm 主要抗原蛋白基因。

2.2.2 重組抗原蛋白誘導表達

各重組蛋白Western blot 檢測結果（圖5）顯示，分別在30.0、21.5、52.0、37.5 和45.5 kDa 處出現特異性條帶，而誘導的空載對照未出現特異性條帶，表明各個重組蛋白均成功表達。

3 討論

Pm 是巴氏桿菌屬中一種重要的條件性致病菌，可以感染馬、牛、羊、豬、雞、鴨等多種重要經濟動物，常引起動物出現敗血癥等并導致死亡，造成了巨大經濟損失。本試驗從發病死亡仔豬臟器中分離出一株病原菌，經形態學觀察、培養特性鑒定、生化鑒定及Kmt基因PCR 檢測等綜合分析，確定該分離株為一株豬源Pm。

近年來抗生素濫用導致多重耐藥菌產生，而臨床上常用豬巴氏桿菌病疫苗主要是采用莢膜抗原B 型的豬源Pm 經甲醛滅活制備，存在滅活不完全的潛在風險，同時滅活苗對同抗原型的保護力較好而對A 型和D 型Pm 的交叉保護力還有待提高。因此篩選出具有良好交叉免疫原性的抗原蛋白，研發單價或多價重組亞單位疫苗顯得尤為重要[7-8]。OmpH和OmpA蛋白作為Pm外膜蛋白的重要組分，有研究[9-11]表明，單獨或融合表達兩個蛋白均可給宿主動物提供一定保護力，但保護力差于弱毒苗或滅活苗。脂蛋白pIpE 是另一類大量存在于Pm 外膜上的重要蛋白，研究[4，12]表明，體外重組表達的pIpE 蛋白不僅具有良好保護力，且對不同亞型Pm 具有一定程度的交叉保護性。三聚體自轉運蛋白TAA 是在革蘭氏陰性菌外膜上廣泛分布的一類重要蛋白，影響病原菌對宿主細胞的吸附、侵襲以及生物膜形成[13]；天冬氨酸裂解酶AspA 蛋白是巴氏桿菌生命活動過程中一種重要分泌蛋白，該蛋白除了發揮其正常生物學功能以外也能給宿主動物提供較好的免疫保護力。這兩類蛋白均可以作為研發新型亞單位疫苗的候選靶標[14-16]，但目前國內外相關研究較少，且關于豬源Pm 相關蛋白的研究還未見相關報道。

本試驗成功分離了一株豬源Pm，并以其基因組為模板成功克隆了5 個主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA），使用原核表達載體pCold-I 構建了相關基因的重組質粒，經Western blot 檢測發現5 個重組蛋白均成功表達。本試驗首次克隆并表達了豬源PmAspA和TAA基因，為相關蛋白免疫原性研究奠定了基礎，同時也有助于對豬源Pm 常見抗原蛋白開展系統性比較，從而篩選出抗原性較強且能提供良好交叉保護力的抗原蛋白。