一例牛莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌與傳染性胸膜肺炎的混合感染研究

杜 瑋 陳古麗 瑪依拉·艾尼瓦 阿曼古麗·牙森 汪 陽(yáng) 苗書(shū)魁 汪 萍夏俊李威*

（1新疆畜牧科學(xué)院，新疆烏魯木齊 832003；2新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830000；3新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830000；4新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000）

巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的在野 生動(dòng)物和畜禽中廣泛傳播的傳染病。敗血癥和出血性炎癥為急性病例的特征，由此被稱(chēng)為出血性敗血癥[1]，表現(xiàn)為皮下、關(guān)節(jié)以及各臟器的局灶性化膿性炎癥為慢性病例的特征。巴氏桿菌病由于在很多動(dòng)物中并沒(méi)有表現(xiàn)出血性敗血癥的特點(diǎn)，但是其他一些疾病卻有出血性敗血癥的特征。因此，為避免混淆，將其命名為多殺性巴氏桿菌更為合適。

牛傳染性胸膜肺炎的別名是牛傳染性支原體肺炎，俗稱(chēng)牛肺疫，主要是由肺炎支原體感染引起的一種急性接觸性傳染病。該病的臨床癥狀明顯，病牛咳嗽、體溫升高，牛群的正常生長(zhǎng)發(fā)育受到影響。感染該病的牛年齡大小不同，牛的致死率也略有不同。該病主要病理變化是纖維素性胸膜肺炎，病死率高、急性耐受的逐漸轉(zhuǎn)為慢性型的病牛，成為養(yǎng)殖場(chǎng)主要傳染源，是造成疾病反復(fù)流行和蔓延的主要原因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑有BHI培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、DL2000核酸Marker。試驗(yàn)儀器有200 μL移液器、培養(yǎng)皿、5 mL注射器。試驗(yàn)動(dòng)物為19～23 g健康巴貝斯小鼠6只。

1.2 臨床檢查及剖檢

通過(guò)常規(guī)的臨床檢查方法檢查病牛，并剖檢死亡牛只，然后逐一觀察每個(gè)臟器的病變情況并將有明顯病變的臟器進(jìn)行摘取拍照，記錄其病變情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)室診斷

1.3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)。在無(wú)菌條件下處理牛的肺臟病變組織，即首先將肺臟組織剪取部分涂抹于BHI固體培養(yǎng)基上，其次剪取另外一部分接種到BHI液體培養(yǎng)基上，最后將固體培養(yǎng)基放到37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，將液體培養(yǎng)基放到37℃水平搖床上，在150 r/min條件下增菌培養(yǎng)24 h。

1.3.2 革蘭氏染色和鏡檢。從搖床上取出培養(yǎng)的菌液，觀察增菌培養(yǎng)是否成功，若有大量細(xì)菌長(zhǎng)出便可用常規(guī)染色方法進(jìn)行革蘭氏染色，染色完畢后鏡檢并觀察目的細(xì)菌的形態(tài)。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)到一定時(shí)間后觀察，如果有菌落長(zhǎng)出就選取疑似巴氏桿菌的菌落染色并鏡檢觀察其形態(tài)。最后挑取疑似巴氏桿菌的單菌落接種到液體培養(yǎng)基中，然后放到37℃水平搖床上培養(yǎng) （150 r/min），24 h后取出菌液染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。此過(guò)程是將細(xì)菌進(jìn)一步純化，使目的細(xì)菌更加容易被分離出來(lái)。

1.3.3 巴氏桿菌PCR檢測(cè)。將培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物為巴氏桿菌鑒定引物和巴氏桿菌a型鑒定引物；擴(kuò)增體系為 25 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各 1 μL，超純水補(bǔ)至 25 μL，混合后放到PCR擴(kuò)增儀中。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃循環(huán)變性 30 s，56℃退火復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，最后在4℃下保存。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物回收后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 支原體病原PCR檢測(cè)。將牛的肺臟組織進(jìn)行充分研磨，將其處理成組織懸液后參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。參照已報(bào)道的牛傳染性胸膜肺炎基因的保守序列及文獻(xiàn)[2]，用生物軟件DNAstar設(shè)計(jì)鑒定引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法同上。

1.3.5 致病性試驗(yàn)。將純化的菌液分別給4只健康小鼠的腹腔注射200 μL，對(duì)照組將生理鹽水分別給另外2只健康小鼠的腹腔注射200 μL，并隨時(shí)觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及剖檢病變組織分析

該病發(fā)病急且快，病牛會(huì)表現(xiàn)出離群獨(dú)居的現(xiàn)象。剛發(fā)病時(shí)，病牛發(fā)燒至42℃，呼吸頻率加快，精神狀態(tài)萎靡，身體日漸消瘦，生長(zhǎng)發(fā)育不好，被毛沒(méi)有光澤且比較凌亂是大多數(shù)病牛的狀態(tài)。隨著病情加重，患病牛停止進(jìn)食，不規(guī)律反芻，有清鼻液流出，然后變稠。咳嗽1周以后，病牛病癥加重，開(kāi)始出現(xiàn)干咳并伴有疼痛，腹部明顯起伏，頻頻顧腹，有氣喘的表現(xiàn)，氣管內(nèi)可以聽(tīng)到明顯的鼾聲。生病牛只流出鐵銹色鼻液，而且經(jīng)常粘在鼻腔上面。解剖病牛后發(fā)現(xiàn)，病變主要集中在肺和胸膜。胸腔內(nèi)積聚大量淡紅色或淡黃色纖維狀滲出液，數(shù)量有多有少。仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)這些滲出液里有少量纖維網(wǎng)狀物質(zhì)或有的貼附在肺臟組織的表面[3]。剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)病死牛的肺組織表面有大小不一樣的明顯的膠體浸潤(rùn)和肝臟病灶。病變肺組織腫大，質(zhì)地堅(jiān)硬，切面大理石狀是該病病死牛的典型特征。

2.2 革蘭氏染色及鏡檢結(jié)果分析

BHI固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況良好，有圓形、半透明狀、質(zhì)地濕潤(rùn)小菌落（圖1）長(zhǎng)出。鏡檢可見(jiàn)球桿形狀，單個(gè)或者成對(duì)排列的革蘭氏陰性菌（圖2）。

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果分析

PCR 結(jié)果表明，在 492、980、512、510 bp 處均出現(xiàn)明亮條帶（圖3、4），與預(yù)期相符，說(shuō)明牛支原體、牛莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌均呈陽(yáng)性。

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果分析

試驗(yàn)組和對(duì)照組注射相應(yīng)液體后8 h，試驗(yàn)組小鼠開(kāi)始行為呆滯，不喜進(jìn)食，12 h后陸續(xù)死亡。對(duì)照組的小鼠正常進(jìn)食和活動(dòng)，且沒(méi)有死亡小鼠（圖5）。

3 結(jié)論與討論

牛傳染性胸膜肺炎的診斷和預(yù)防技術(shù)已經(jīng)比較成熟。相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，我國(guó)的中獸醫(yī)對(duì)該病的治療方法多種多樣，符合我國(guó)當(dāng)今社會(huì)對(duì)綠色產(chǎn)品以及無(wú)公害養(yǎng)殖的追求。因此，該病的治療已經(jīng)逐步實(shí)行中獸醫(yī)治療以及借助西醫(yī)準(zhǔn)確診斷，中醫(yī)針對(duì)性對(duì)癥治療，中西醫(yī)結(jié)合，中醫(yī)調(diào)理治療病牛和西醫(yī)輔助治療方法等，使養(yǎng)殖生產(chǎn)的牛肉產(chǎn)品最大程度地滿足公眾的需求，有利于養(yǎng)殖戶進(jìn)一步提高養(yǎng)殖效率。動(dòng)物抵抗力是巴氏桿菌病發(fā)生的先決條件，任何會(huì)降低動(dòng)物抵抗力的因素都會(huì)促進(jìn)巴氏桿菌病的發(fā)生和流行。氣溫突降會(huì)使動(dòng)物的抵抗力下降，多殺性巴氏桿菌會(huì)趁機(jī)侵入動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)淋巴結(jié)進(jìn)入動(dòng)物的血液從而形成動(dòng)物菌血癥[4-5]。牛肺炎和牛惡性卡他熱易與該病的臨床癥狀相混淆[6]。該次病癥為傳染性胸膜肺炎和巴氏桿菌的混合感染，結(jié)合金映紅等[7]的研究可以看出牛羊感染肺炎不再僅僅是單一感染，而開(kāi)始出現(xiàn)了混合感染現(xiàn)象，且診斷方式應(yīng)以實(shí)驗(yàn)室診斷為主，才能有更準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。

健康的牛身上一般會(huì)有支原體和巴氏桿菌生活，會(huì)導(dǎo)致牛在受到各種應(yīng)激刺激（如斷奶、運(yùn)輸、感冒、營(yíng)養(yǎng)不良等）后發(fā)病。綜合來(lái)看，應(yīng)遵循“管理為主、治療為輔、防治結(jié)合”的原則。當(dāng)發(fā)現(xiàn)有發(fā)病跡象的牛時(shí)，首先應(yīng)立即將所有病牛用具和使用場(chǎng)所隔離，并進(jìn)行全面消毒；病牛痊愈或者癥狀減輕后，不用立即轉(zhuǎn)回健康牛所在的場(chǎng)所，終生飼養(yǎng)在治療圈內(nèi)是最好的辦法；慢性感染或者癥狀較輕的牛只，會(huì)對(duì)外界進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的排毒，從而感染健康牛，因而應(yīng)對(duì)這些牛加強(qiáng)管理，不容忽視；孕牛和斷奶之前的小牛也要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。