不同生理條件下CD36/LKB1/AMPK信號通路在骨骼肌脂肪酸氧化代謝調控中的作用機制研究

孫婧瑜，蘇亞娟，董靜梅

骨骼肌作為脂肪酸氧化代謝的主要場所，在維持機體能量穩態中起到了重要的調控作用（Sanchez et al.，2012）。目前，研究認為骨骼肌脂肪酸攝入的增加和/或氧化的減少導致骨骼肌脂肪酸堆積，過多的脂肪酸堆積又將進一步損害胰島素信號通路，從而導致糖脂代謝紊亂，最終發生2型糖尿?。℅oodpaster et al.，2004）。然而，骨骼肌脂肪酸代謝紊亂與胰島素抵抗間的分子聯系尚未闡明。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）廣泛存在于各種真核細胞中，被認為是2型糖尿病和代謝綜合征治療中一種有效的胰島素增效藥物，能將細胞內脂肪酸代謝與胰島素代謝信號通路聯系起來（Smith et al.，2017）。AMPK的激活一方面導致骨骼肌脂肪酸氧化代謝增加（O’Neill et al.，2014），另一方面促進線粒體生物發生（O’Neill et al.，2013），從而調節骨骼肌脂肪酸的代謝平衡，最終改善胰島素敏感性。近期研究顯示，AMPK的激活除了受AMP/ATP比值的主要調控外，還受其他分子機制的調控，即依賴AMP/ATP比值的改變和不依賴AMP/ATP比值的改變（Ke et al.，2018）。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）被認為是胰島素外周組織中激活AMPK的主要上游激酶，可直接磷酸化AMPK，調節細胞能量代謝（Lee et al.，2007）。目前，多數研究認為，運動可能通過影響AMP/ATP的比值，促進LKB1激酶對AMPK的激活（Jeppesen et al.，2013）。然而，是否還有其他途徑激活LKB1-AMPK信號通路，尚不清楚。另外，不同生理條件下LKB1如何激活AMPK，亦不明確。因此，本研究著重探討不同生理條件下激活AMPK的上游信號通路及其在改善骨骼肌脂肪酸氧化代謝中的作用。

近年來，與脂肪酸代謝有關的膜蛋白相繼被發現。脂肪酸轉運蛋白-1（fatty acid transport protein-1，FATP-1）、膜脂肪酸結合蛋白（plasma membrane fatty acid binding proteins，FABPpm）及脂肪酸轉位酶（fatty acid translocase，FAT/CD36）在肌肉中均有大量表達（Febbraio et al.，2008）。其中，CD36更以分布廣泛且功能機制復雜多樣而備受關注。鑒于脂肪酸氧化代謝與胰島素抵抗和2型糖尿病間的密切關系，許多研究開始關注CD36在胰島素抵抗防治中的作用。我們前期研究結果顯示，CD36通過介導Fyn-LKB1復合物在胞內的動態變化及相互作用，激活AMPK，從而對骨骼肌脂肪酸氧化代謝進行直接調控（Samovski et al.，2015）。另有研究顯示，與其他脂肪酸轉運蛋白相比，CD36在運動等能量需求較大時，對骨骼肌脂肪酸代謝的調控作用可能更為重要（Holloway et al.，2009）。因此，本研究以CD36-LKB1信號通路為切入點，通過構建兩種不同的生理條件（高脂膳食與有氧運動）動物模型，借助細胞分子生物學技術，著重探討CD36是如何通過激活AMPK對骨骼肌脂肪酸氧化代謝進行調控的。

1 材料與方法

1.1 C2C12細胞培養及siRNA干擾

小鼠骨骼肌C2C12細胞系在6孔板內培養，以生長培養基（高糖DMEM、10%小牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素/鏈霉素）培養2天后，改用分化培養基（高糖DMEM、2%馬血清、1%谷氨酸、1%青霉素/鏈霉素）進行分化培養4～6天。在C2C12細胞分化第3天時，換用無抗生素的分化培養基，分別對各組細胞進行siRNA干擾：siCont、siCD36（#1和#2）。siCont：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；siCD36-1：5’-GGAUGACAACUUCACAGUUTT-3’；siCD36-2：5’-CCACAUUUCCUACAUGCAATT-3’購買于 Gene Phar‐ma公司。

6孔板中每孔加入A液（150 μl Optimem、1.5 μl 20 umol/L siRNA）和B液（150 μl Optimem、3 μl Lipofectamine RNAiMAX）（Life Technologies公司）后，將混合物于室溫放置5 min，加入C2C12細胞，于37℃培養箱孵育6 h后，換回分化培養基，繼續分化培養2天。然后，對細胞進行低糖DMEM及無血清饑餓過夜，并用含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細胞，用于后續檢測。

1.2 實驗動物與分組

17只8周齡C57BL/6雄性小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）于同濟大學實驗動物中心飼養訓練。小鼠自由進食飲水。環境溫度20℃～24℃，相對濕度40%～60%，通風良好，晝夜12 h/12 h循環照明。所有操作均嚴格遵守同濟大學道德倫理委員會的要求。小鼠隨機分為對照組（control group，CON；n=6）、高脂組（high fat diet group，HFD；n=6）和有氧運動組（exercise group，EX；n=5）。對照組方案：自由飲食，以基礎飼料喂養8周。高脂膳食方案：高脂飼料（脂肪：60%kcal、碳水化合物：20%kcal、蛋白質：20%kcal）喂養8周。有氧運動方案：小鼠給予基礎飼料喂養，適應性跑臺訓練1周后，以20 m/min跑速，6次/周，60 min/次進行運動并持續至第8周。基礎飼料及高脂飼料均由上海斯萊克實驗動物中心提供。

1.3 動物取材

最后一次實驗干預后，對小鼠禁食12 h，然后取材。小鼠麻醉后頸椎脫位致死，迅速分離雙側腓腸肌，進行蛋白質印跡、免疫熒光、電鏡、酶活等實驗檢測。剩余組織置于-80℃冰箱冷凍待用。

1.4 蛋白質印跡實驗

取60～80 mg腓腸肌置于含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（Beyotime公司）中，剪碎后充分勻漿（或C2C12細胞裂解液），冰上靜置30 min后，離心機12 000 rpm、4℃離心10 min，取上清。BCA法（#20201ES76，YESEN公司）測定蛋白樣品濃度后進行煮沸變性。蛋白樣品經過SDSPAGE電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜。p AMPK（T172）（#2535）、p ACC（S79）（#3661）購買于 Cell signaling公司，CD36（AF2519）購買于R&D systems公司，PGC-1α（H-300）（sc-13067）購買于 Santa Cruz Biotechnology公司 ，GAPDH（G8795）購買于Sigma-Aldrich公司。TBST洗膜3次，每次 5 min，二抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h。采用 ECL（#36208ES60，YESEN公司）發光法檢測目標蛋白條帶，并用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 免疫熒光雙標實驗

制備腓腸肌冰凍切片，置于4%多聚甲醛冰上固定60 min，室溫封閉 60 min后，加入 LKB1一抗（LKB1，1∶200，5c10，Millipore公司），4℃孵育過夜。然后加入Alexa Fluor 488標記的二抗（1∶500），室溫孵育 60 min。滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑（#36308ES11，YESEN公司）封片。使用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。熒光強度反映LKB1蛋白表達的變化情況，共定位程度反映LKB1向細胞質轉位的情況。

1.6 超微結構透射電鏡實驗

剪取體積為3 mm×3 mm×3 mm的骨骼肌組織，取材過程中盡量減小對組織的牽拉、挫傷與擠壓等機械損傷，迅速投入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定3 h以上。然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS（pH 7.4）漂洗3次，每次10 min，0.5%的鋨酸0.1 mol/L固定3 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS（pH 7.4）漂洗3次，每次10 min，依次放入50%、70%、80%、90%、95%、100% 酒精中脫水，每次 15 min。Spurr樹脂浸透包埋，70℃聚合48 h。切片機切60～80 nm超薄切片，鈾鉛雙染色（2%醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，各染色10 min），切片室溫干燥，于透射電子顯微鏡下進行拍攝。

1.7 線粒體呼吸鏈酶活性檢測

根據說明書，使用相應的分析試劑盒（南京建城生物工程研究所）測定骨骼肌中腺苷三磷酸酶（ATP synthase，ATPase）及檸檬酸合成酶（citrate synthetase，CS）的活性。用TECAN微孔板法記錄吸光度。

1.8 數據處理

實驗數據采用SPSS 20.0軟件處理，結果以平均數±標準誤（M±SEM）表示。組間比較采用ANOVA單因素方差分析，顯著性差異水平設置為P＜0.05。

2 實驗結果

2.1 CD36缺乏對骨骼肌細胞脂肪酸氧化代謝信號通路AMPK/ACC激活的影響

圖1顯示，經siCD36干擾后的C2C12細胞中CD36蛋白表達水平顯著下降（P＜0.001），說明本實驗中的CD36基因敲低效率較好。進一步研究發現，經siCD36干擾后的C2C12細胞，AMPK、乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）磷酸化水平顯著增加（P＜0.01，P＜0.05），說明CD36基因缺乏能夠激活骨骼肌細胞脂肪酸氧化信號通路。

圖1 CD36缺乏對C2C12小鼠骨骼肌細胞相關蛋白表達水平的影響Figure 1.Effect of CD36 Deficiency on Related Protein Expression Levels in C2C12 Cells

2.2 不同生理條件對小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平的影響

圖2顯示，與CON組小鼠相比，8周高脂膳食能夠誘導小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平的增加（P＜0.01）；然而，經過8周有氧運動的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平雖有增加的趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。進一步研究發現，與HFD組相比，EX組小鼠骨骼肌CD36蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。該結果說明，不同生理條件下，小鼠骨骼肌CD36蛋白表達水平不同。

圖2 不同生理條件對小鼠骨骼肌CD36蛋白表達水平的影響Figure 2. Effect of Different Physiological Conditions on the Expression Levels of CD36 Protein in Skeletal Muscle of Mice

2.3 不同生理條件對小鼠骨骼肌AMPK/ACC信號通路激活的影響

與CON組小鼠相比，經過8周高脂膳食干預的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.05，圖3）；經過8周有氧運動的小鼠骨骼肌AMPK蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05）。與高脂膳食組小鼠相比，經過8周有氧運動的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）。結果說明，不同生理條件刺激對小鼠骨骼肌AMPK/ACC信號通路激活程度不同。

圖3 不同生理條件對小鼠骨骼肌AMPK/ACC信號通路激活的影響Figure 3.Effect of Different Physiological Conditions on the AMPK/ACC Signaling Pathway Activation in Skeletal Muscle of Mice

2.4 不同生理條件對小鼠骨骼肌LKB1向細胞核轉位的影響

本研究進一步評估不同生理條件下LKB1的胞內動態轉位。小鼠骨骼肌組織LKB1免疫熒光檢測結果顯示，LKB1被標記為綠色熒光，細胞核被DAPI標記為藍色，二者的共定位重疊區域為藍綠色（圖4）。本研究結果顯示，與CON組相比，HFD組綠色熒光與細胞核共定位程度較為明顯，說明HFD能夠誘導LKB1向細胞核聚集。與HFD組相比，EX組綠色熒光與細胞核共定位區域減少。

圖4 不同生理條件對小鼠骨骼肌LKB1向細胞核轉位的影響（×400）Figure 4.Effect of Different Physiological Conditions on LKB1 Translocation to Cell Nucleus in Skeletal Muscle of Mice（×400）

2.5 不同生理條件對小鼠骨骼肌線粒體生物發生調控因子PGC-1α蛋白表達水平的影響

圖5顯示，與CON組小鼠相比，經過8周有氧運動干預的小鼠骨骼肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coacti‐vator-1，PGC-1α）蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05），該結果說明，有氧運動可能通過增加PGC-1α的表達，促進線粒體生物發生。然而，與CON組相比，經過8周高脂膳食干預的小鼠骨骼肌PGC-1α蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同生理條件對小鼠骨骼肌PGC-1α總蛋白表達水平的影響Figure 5. Effect of Different Physiological Conditions on the Expression Levels of PGC-1α Protein in Skeletal Muscle of Mice

2.6 不同生理條件對小鼠骨骼肌線粒體結構的影響

在透射電鏡下觀察發現，CON組小鼠骨骼肌肌絲結構清晰，肌小節排列整齊，橫紋清楚，Z線、M線結構清晰，肌絲間線粒體排列整齊，呈橢圓形，嵴結構清晰，排列密集。HFD組骨骼肌肌絲結構明顯紊亂，典型肌小節結構消失，大部分線粒體超微結構發生了明顯的破壞，表現為線粒體排列紊亂，腫脹，部分嚴重的線粒體嵴和基質消失出現空泡樣改變。EX組骨骼肌結構較為清晰、肌小節排列較整齊，線粒體數量增多、體積增大、形態較HFD明顯改善（圖6）。

圖6 透射電鏡下不同生理條件小鼠骨骼肌線粒體超微結構形態學改變Figure 6.Ultrastructural Changes of Muscular Mitochondria Under Transmission Electron Microscope

2.7 不同生理條件對小鼠骨骼肌線粒體相關酶活性的影響

線粒體呼吸鏈相關酶的活性已廣泛應用于線粒體功能的估計（Lobo-Jarne et al.，2008）。因此，我們通過檢測ATPase活性和CS活性來評估不同生理條件對骨骼肌線粒體功能的影響。研究結果表明，有氧運動干預顯著增加ATPase活性（P＜0.05），而高脂膳食干預顯著降低CS的活性（P＜0.05）。說明高脂膳食能降低線粒體功能，運動干預能改善線粒體功能。

圖7 不同生理條件對小鼠骨骼肌線粒體酶活性的影響Figure 7.Effect of Different Physiological Conditions on Mitochondrial Related Enzymes Activities in Skeletal Muscle of Mice

3 分析與討論

高脂膳食是導致飲食性肥胖發生的重要原因之一，而適量的運動是目前國際上公認的控制飲食性肥胖安全、有效的途徑。AMPK作為一種細胞內能量傳感器和調節劑，在細胞能量消耗時被激活，從而誘導ACC的失活，增加骨骼肌脂肪酸的氧化代謝。然而，激活AMPK/ACC的上游信號分子，尚不清楚。因此，本研究利用高脂膳食及有氧運動兩種不同生理條件，著重探討了CD36作為信號分子，可能通過誘導LKB1的胞內轉位，激活AMPK/ACC信號通路，并且通過調控PGC-1α改善線粒體數量及功能，最終對骨骼肌脂肪酸氧化代謝進行調控。

3.1 不同生理條件對CD36-AMPK信號通路的影響

CD36是細胞表面重要的FA受體，與骨骼肌胰島素抵抗的發生關系密切（Samovski et al.，2018）。在肥胖人群及2型糖尿病患者的骨骼肌細胞膜上均發現了CD36高表達，從而導致脂質過量累積，這可能是骨骼肌胰島素抵抗發生的重要原因之一（Bonen et al.，2004）。激活的AMPK一方面通過誘導GLUT4和CD36向細胞膜轉位（Hames et al.，2014），增加骨骼肌胰島素敏感性；另一方面，激活的AMPK通過ACC的失活來增加長鏈脂肪酸β氧化，從而增加細胞內脂質消耗。因此，骨骼肌中AMPK信號受損與FA氧化能力下降及胰島素抵抗發生有關（Tanaka et al.，2001）。與AMPK相似，CD36能夠促進FA向細胞膜的轉運，從而影響骨骼肌脂肪酸的攝取及氧化。禁食、機械收縮等生理條件均能誘導CD36向細胞膜的轉位（Silverstein et al.，2009）。因此，CD36誘導的FA攝取和氧化的協同增加有助于胰島素抵抗骨骼肌細胞FA代謝。

本研究首先利用小RNA干擾技術，在細胞水平上探討CD36缺失對AMPK/ACC信號通路的影響。結果表明，CD36基因沉默能夠顯著增加AMPK/ACC磷酸化水平，說明CD36基因缺乏能夠激活骨骼肌細胞脂肪酸氧化代謝信號通路。然后，進一步研究不同生理條件下CD36對AMPK/ACC信號通路激活的影響，結果發現，與對照組相比，在CD36高表達的高脂膳食組，AMPK/ACC磷酸化水平顯著降低；與高脂膳食組相比，在CD36低表達的有氧運動組，AMPK/ACC磷酸化水平顯著增加。該結果進一步驗證了細胞水平上的結論，即CD36可能作為信號分子對AMPK激活進行調控。然而，有氧運動對小鼠骨骼肌CD36的表達無顯著影響，說明有氧運動可能不通過CD36總蛋白的調控激活AMPK/ACC信號通路。

高脂膳食能夠增加CD36蛋白表達，該結果與Roep‐storff等（2004）的研究相一致。這可能是因為在高脂膳食的持續作用下，CD36作為骨骼肌中重要的脂肪酸轉運載體，通過誘導自身表達的變化，增加外源性脂肪酸的攝入，以促進線粒體的氧化代謝，從而消耗掉攝入的過量脂肪酸，對骨骼肌脂質堆積起到保護作用。然而，經過長時間耐力運動后，骨骼肌CD36總蛋白的表達水平呈現多元化的調控。有研究顯示，急性耐力運動能夠誘導人體骨骼肌CD36總蛋白表達水平的增加（Holloway et al.，2006）。然而，對有兩年以上耐力訓練經歷的受試者進行檢測，發現長期的耐力訓練并不能提高股外側肌CD36總蛋白的表達（Kiens et al.，2004）。本研究結果顯示，與對照組小鼠相比，經過8周有氧運動的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平雖有增加的趨勢，但無顯著性差異。結合他人的研究結果，推測CD36蛋白表達水平可能與有氧運動干預的時間及干預方式有關。比如，骨骼肌CD36蛋白表達水平的升高可能是對運動訓練初期的一個暫時性的適應過程，而這種適應性的過程可能會隨著運動訓練時間的延長而逐漸消退。因此，在今后的研究中，可以選取運動初期、運動中期以及運動末期的多個時間點進行檢測，從而可以更清晰地反映CD36總蛋白含量在運動適應過程中的變化。

研究顯示，長期高脂膳食誘導的肥胖或胰島素抵抗大鼠骨骼肌中AMPK磷酸化水平顯著減少（Lessard et al.，2007）。Liu等（2006）發現，5個月的高脂膳食能夠導致骨骼肌AMPK、ACC蛋白的磷酸化水平顯著下降，導致胰島素抵抗的發生。主要原因可能是，長期的高脂膳食一方面可能通過降低AMPK/ACC的磷酸化水平，損傷骨骼肌脂肪酸氧化代謝；另一方面，在高脂膳食的作用下，進一步導致骨骼肌內脂肪酸的堆積，從而影響胰島素敏感性。本研究結果亦顯示，高脂膳食能顯著降低骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平。另外，本研究結果顯示，有氧運動干預能增加骨骼肌AMPK、ACC的蛋白磷酸化水平，該結果與Cao等（2012）的研究結果相一致。這可能是由于有氧運動誘導的骨骼肌AMPK、ACC磷酸化水平增加是對能量失衡的一種代償性適應過程。綜上所述，CD36可能作為信號分子激活AMPK。然而，CD36激活AMPK的途徑，尚不清楚。

3.2 不同生理條件下LKB1胞內轉位對AMPK激活的作用

LKB1作為AMPK上游分子，可以對AMPK進行直接調控，從而參與骨骼肌FA氧化代謝（Hardie et al，2013）。然而，不同生理條件下LKB1對AMPK的激活作用，尚不清楚。目前，對蛋白胞內動態變化的研究技術相對成熟。因此，我們前期工作已有效鎖定LKB1胞內動態變化對AMPK激活的效應方式，即棕櫚酸作為CD36的配體，通過減少CD36與Fyn的結合能力，減少Fyn對LKB1的激活，從而抑制LKB1向細胞核的轉位，使滯留在細胞質內的LKB1增多，從而激活AMPK，最終對脂肪酸氧化代謝起到調控作用（Samovski et al.，2015）。然而，不同生理條件下是否也通過影響CD36，抑制LKB1向細胞核的轉位，激活AMPK信號通路，從而改善骨骼肌脂肪酸氧化代謝，尚不清楚。因此，我們進一步評估了不同生理條件下LKB1的胞內動態轉位。研究結果顯示，HFD組LKB1與細胞核共定位程度較為明顯，說明高脂膳食干預能夠誘導LKB1從細胞質向細胞核的轉位，這可能是激活AMPK的重要原因，該結果與Thomson等（2007）的研究結果相一致。然而，有研究發現，AMPK缺失對AICAR誘導的FA氧化代謝無影響（Dzamko et al.，2008）。這可能是因為LKB1的下游靶點除了AMPK外，還有其他下游靶點對FA氧化代謝進行調控。因此，我們進一步探討了不同生理條件下LKB1胞內轉位激活的其他下游靶點。

在線粒體能量代謝過程中，PGC-1α作為一種激活劑，在協調線粒體生物發生及代謝相關信號通路中起著重要的作用。最直接的證據是PGC-1α基因的過表達能夠增加線粒體數量，提高線粒體功能。相反，PGC-1α的缺失導致線粒體功能障礙及代謝紊亂（Handschin et al.，2007）。因此，PGC-1α可能是LKB1作用的下游靶點之一。進一步研究發現，AMPK可能通過調控骨骼肌PGC-1α和線粒體相關酶的表達，改善線粒體功能（Jager et al.，2007）。本研究結果顯示，運動能激活小鼠骨骼肌AMPK，增加PGC-1α表達及線粒體數量。結果表明，AMPK激活至少可以部分通過調控PGC-1α，增加線粒體的數量及其功能。這可能是因為運動導致的能量缺乏，通過增加AMP/ATP的比率啟動了AMPK/PGC-1α途徑。AMPK/PGC-1α是調控線粒體能量代謝的重要信號途徑，通過感知細胞內的能量狀態對線粒體生物發生及其功能進行直接調控，與糖尿病發生、發展關系密切（Wu et al.，2016）。

綜上所述，我們提出以下科學假設：HFD誘導的CD36高表達，促進LKB1從細胞質向細胞核的轉位，使滯留在細胞質內的LKB1減少，從而減少了LKB1對AMPK的激活作用。AMPK激活的減少，一方面能夠抑制ACC的磷酸化，減少脂肪酸的氧化代謝；另一方面通過調控線粒體相關基因，減少線粒體的數量，損傷線粒體功能（圖8）。

圖8 CD36/LKB1/AMPK信號通路在調控骨骼肌脂肪酸氧化代謝中的作用機制示意圖Figure 8.The Role of CD36/LKB1/AMPK Signaling Pathway in Regulating Skeletal Muscle FA Oxidation Metabolism

4 結論

本研究在細胞及組織層面上證實CD36作為信號分子，而非脂肪酸轉運載體，當siRNA誘導CD36低表達時，激活AMPK；而HFD誘導CD36高表達時，通過誘導LKB1從細胞質向細胞核的轉位，抑制AMPK/ACC信號通路激活，從而對脂肪酸氧化代謝進行調控。