應用高分辨質譜法的馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留快速篩查方法

高 磊，王美仙，郭威艷

(1.內蒙古自治區烏蘭察布市農畜產品質量安全監督管理中心，內蒙古 烏蘭察布 012000；2.內蒙古自治區烏蘭察布市農牧業綜合執法支隊，內蒙古 烏蘭察布 012000)

0 引言

人口數量的急速上升，對于食物的需求量也逐漸增大，市場對于各類農產品的需求逐年上升，在保證農產品產量提升時一般需要使用不同成分的農藥抑制病蟲危害。目前我國市面上常使用的農藥數量約有1 600種，年用量超過200萬t，是目前世界上農藥使用數量最龐大的國家，但是大量使用農藥很容易使其殘留在農作物中，并且大量噴灑農藥還會對土壤和水源造成嚴重污染，長期食用殘留農藥的農作物也會嚴重危害人們的身體健康[1]。嘧菌酯是一種有機化合物，純品是一種呈現出淺棕色色澤的棕色結晶固體，沸點高于500 ℃，在水解過程中呈現穩定狀態，是近年來由國外引入的新型農藥，在眾多農作物種植中已經廣泛使用，屬于甲氧基丙烯酸酯型殺菌農藥，對農作物生產過程中經常出現的霜霉病、白粉病都具有良好的控制效果[2-4]。該農藥不但能夠噴灑在土壤中還可以直接在種子階段實現病蟲害處理，對于根莖類作物、蔬菜、谷物等作物均有良好的處理效果。但是由于嘧菌酯具有特殊性，如果嘧菌酯與有機類農藥混合使用會由于強烈的粘著性與滲透性導致作物出現藥害情況。嘧菌酯農藥具有諸多特點：僅需少量用藥就能消滅多種病蟲危害，能夠有效降低農藥使用成本；能夠提升作物的抗病性能，保證作物提前上市，為種植戶帶來最優成本；使用嘧菌酯農藥即使在天氣不佳的情況下依舊保證作物生長；使作物的收獲期拉長，提升作物整體產量；有效期較長，每次藥效能夠持續15 d以上；毒性較低，無公害性能較強。盡管嘧菌酯已經屬于性能較好的農藥，但是大量殘留在土壤中仍然會造成較為嚴重的環境污染和作物危害，需要探索嘧菌酯殘留快速篩查方法[5]。

對于農藥中各類物質的殘留測定學術界通常使用質譜技術。近年來，隨著質譜技術的進步，高分辨質譜技術逐漸發展并完善起來。高分辨質譜法能夠獲得通量較高的非靶向定量分析與定性篩查，不會受到被篩查樣品種類與數量的限制[6-8]。定性篩查嘧菌酯殘留時能夠通過匹配高分辨數據庫獲得的結果，不用依賴篩查對照組，同時能夠準確回溯數據內容，做到有據可查。

基于以上優點，本文應用高分辨質譜法快速篩查馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留，為今后馬鈴薯的增產種植提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣本：馬鈴薯種植土壤礦質養分充足，肥力較強，夾雜半風化母質碎塊；呈現紅色質地，pH值顯示為弱酸性，富含鐵元素及鋁元素，鹽基高度不飽和，同時富含有機物與腐殖質，鉀元素與磷元素豐富；屬于壤質粘土，土質疏松呈現屑粒狀結構。

材料：25%嘧菌酯懸浮劑(河南省安陽市振華化工有限公司)；乙腈(山東省淄博市協創化工有限公司)；丙酮(江蘇省揚州市貝爾新環境科技有限公司)；二氯甲烷(山東省濟南市坤豐化工有限公司)；無水硫酸鈉(湖北省武漢市華翔科潔生物技術有限公司)；弗羅里硅土柱(湖北省武漢市敬信科技有限公司)；石油醚(江蘇省蘇州市森菲達化工有限公司)；乙酸乙酯-環乙烷(山東省濟南市盈鑫化工有限公司)；色譜柱(天津市西納智能科技有限公司)。

儀器：四極桿-飛行時間高分辨質譜系統(沃特世飛行技術有限公司)；液相色譜系統(廣東省通用儀器有限公司)；液相色譜儀(北京市京科瑞達科技有限公司)；三重四極桿質譜儀(山東省梁山市鈺豪儀器設備有限公司)；渦旋混合器(河北省滄州市筑龍工程儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(浙江省杭州市舍巖儀器有限公司)。

1.2 方法

高分辨質譜法是近年來檢測土壤或農作物中農藥殘留情況經常使用的方法，本文研究中使用的高分辨質譜法為飛行時間質譜法，同時結合四級桿串聯與高效液相色譜法篩查馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯殘留情況[9]。研究在馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯隨著時間推移殘留量消解變化規律，經高分辨質譜法分析獲得馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯原始沉積量及嘧菌酯殘留時空變化，同時計算馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯殘留半衰期[10]。

1.2.1 土壤樣品準備

為了方便后續試驗，劃分試驗區域為每個區域10 m2，并設置保護圍欄。實施嘧菌酯消解變化規律試驗時施加2倍嘧菌酯劑量，按照常規比例充分混合水與2倍嘧菌酯懸浮劑，均勻噴灑在樣本土壤上至土壤充分濕潤停止，采樣時間分別為施藥后的1、2、5、7、15、20、40、60、80、100與120 d。在樣品區域取1 kg土壤樣品，分別放置在惰性干凈的塑料袋中，并注明標簽后攜帶回實驗室。使用自然風將土壤樣品風干，風干過程中使用干凈無菌的薄紙覆蓋土壤樣品，防止其他干擾因素混入，風干完成后簡單過篩并研磨處理，再次使用惰性塑料包裝袋裝好置于冰箱內待提取，冰箱溫度為-21 ℃。

1.2.2 樣品的提取

嘧菌酯是一種有機化合物，在殘留情況篩查過程中需要考慮嘧菌酯的極性，同時篩查過程中也要考慮嘧菌酯及溶液性質、基質的特點，從而選取較為恰當的提取溶劑[11-12]。已有研究中，由于丙酮具有良好的滲透力，經常作為農藥中各類物質的提取溶劑，因此選取該試劑輔助篩查。具體過程：將丙酮適當酸化，有利于從馬鈴薯種植土壤中提取出嘧菌酯成分，優化提取效率。

為保證精準提取馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯，并且確保具有較高的回收率，將丙酮溶液與占液體總質量0.1%的冰醋酸混合，確保嘧菌酯回收率范圍為60%～100%[13]。不同地域的馬鈴薯種植土壤中的基質存在差異，部分基質對于嘧菌酯回收率較高，然而土壤中基質的硫化物、生物堿等物質較高將會嚴重影響嘧菌酯的回收率。為實現嘧菌酯的高效回收，對于土壤樣品可能存在的干燥情況，加水濕潤處理[14]。

簡單研磨處理土壤并稱取25 g土壤樣本，置于容量500 mL的三角瓶中，在三角瓶中添加25 mL去離子水，充分浸泡土壤，浸泡時間設置為20 min。浸泡完成后在三角瓶中添加75 mL丙酮，利用振蕩儀充分振蕩，振蕩時間設置為35 min。完成振蕩后抽濾溶液，使用35 mL丙酮沖洗兩次液體殘渣，沖洗完成后合并溶液。取一個容量為300 mL的平底燒瓶，將溶液轉移至該平底燒瓶中，恒溫水浴鍋溫度設置為45 ℃，將溶液置于水浴鍋中實行減壓濃縮至25 mL方可停止，取一支容量為500 mL的分液漏斗，向漏斗轉移溶液，與氯化鈉水溶液(100 mL，5%濃度)混合，萃取時引入二氯甲烷液，使用硫酸鈉收集二氯甲烷層，水浴鍋溫度調至40 ℃，減壓濃縮，使得溶液接近干燥，使用氮氣將半固體吹干處理后靜置。

1.2.3 樣品的凈化

取經過脫活的弗羅里硅土柱3 g，使用約1 cm無水硫酸鈉施加在弗羅里硅土柱兩端，再使用石油醚25 mL對弗羅里硅土柱預淋。取提取的土壤樣本，用乙酸乙酯-環乙烷3.5 mL實現溶解，溶解完成后上柱，使用純水與純甲醇混合液洗脫土壤中嘧菌酯，收集流出的液體。減壓狀態下設定恒溫水浴鍋溫度為45 ℃，將溶液濃縮接近干燥，使用氮氣吹干，定容固體時使用乙酸乙酯，靜置等待后續測定。

1.2.4 色譜條件與標準曲線繪制

色譜柱：型號為BDS-C18，規格為260 mm×4.5 mm×4.5 μm。

流動相：使用甲醇與水組合的混合物，二者體積比例為6∶4。

流速設為0.9 mL/min，色譜柱溫度設為35 ℃，檢測波長與進樣體積分別為265 nm與11 μm。

使用外標分析法繪制標準曲線，調配嘧菌酯母液，濃度設定為550 mg/L，通過稀釋法制備嘧菌酯標準液，濃度分別為0.02、0.06、0.12、0.48、1.10和5.10 mg/L，進樣量設定為1 μL，由此得出標準曲線。

1.2.5 質譜條件

設定毛細管電壓(正負離子模式)與電噴霧離子源溫度分別為3 200 V與300 ℃；設定質譜正、負離子模式的掃描范圍分別為110～1 100與400～450 m/z；正、負離子掃描切換時間均為1 s；分辨率與掃描頻率分別為70 000與3.6 Hz。

1.2.6 定性篩查

土壤樣品使用高分辨質譜系統中攜帶的篩查軟件構建篩查數據庫，用于分析馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯準確分子量、碎片離子信息及同位素峰型，上述3個指標是篩查土壤中各種農藥殘留的重要指標，目前眾多研究均表明通過篩查數據庫對于農藥類的藥品篩查測試時，定性篩查可行性較高[15]。

1.2.7 濃度差異下嘧菌酯殘留量統計試驗

為進一步驗證馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯最終殘留情況，將土壤樣本劃分成多個區域，間隔7 d分別噴灑濃度為190 g(ai)/hm2的嘧菌酯溶液和濃度為250 g(ai)/hm2的嘧菌酯溶液，一部分土壤樣本施藥3次，一部分土壤施藥4次，分別記錄施藥后距離收獲2、4、6和8 d的嘧菌酯殘留量。

2 結果分析

2.1 凈化效果驗證

在馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留快速篩查時使用弗羅里硅土柱實現樣品的凈化，為獲得嘧菌酯在弗羅里硅土柱上的保留情況，需要先確定石油醚淋洗弗羅里硅土柱的曲線，由此驗證凈化處理效果。凈化淋洗曲線變化效果如圖1所示。

圖1 弗羅里硅土柱上的嘧菌酯洗脫曲線Fig.1 Elution curve of azoxystrobin on Florisil column

由圖1可知，從洗脫劑用量達到14.5 mL開始，土壤溶液的嘧菌酯回收率已經超過90%，且自該用量以后即使依然增加洗脫劑用量嘧菌酯回收率不會發生明顯變化。由此可以看出，凈化處理階段只需保持洗脫劑用量在14.5 mL時就可以保持較好的回收效果，洗脫劑用量的增加并不會對嘧菌酯回收率造成顯著影響。

2.2 色譜情況

在200～410 nm范圍內，樣品掃描時需要使用紫外分光光度計，選擇波長時需要考慮方法適用性和成分響應值等因素，多方驗證后確定波長為255 nm。使用體積比例存在差異的丙酮與水混合物，以及甲醇與水混合物分別開展流動相試驗，試驗開始之前先要確定方法足夠簡單且分離效果快速有效。如果配比中，丙酮在混合物中的占比分別低于總溶液比例的30%，會導致色譜柱大量保留嘧菌酯，造成過晚出峰；相反，如果配比中，丙酮在混合物中的占比分別高于總溶液比例的80%，會導致色譜柱大量保留嘧菌酯，造成過早出峰。如果出現過早或者過晚出峰，都會分離不充分，出現嚴重雜質干擾。綜合這些影響因素，確定丙酮與水之間的比例為6:4的流動相是最佳混合物比例。土壤樣品優化后混合溶液色譜圖如圖2所示。

圖2 溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of solution

經過優化后的色譜圖出現比較尖銳的堆成峰型，保證雜質被較好分離，且時間恰當，符合土壤嘧菌酯殘留分析需求，經過分析，嘧菌酯保留時間約為12.5 min。

2.3 定性篩查結果

通過高分辨質譜系統開展定性篩查，馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯殘留篩查色譜與質譜圖如圖3所示。

圖3a是在全掃描模式下，在5 mg/kg質量數偏差范圍中嘧菌酯離子色譜圖，在此基礎上可以開展精確碎片離子分析與同位素峰型匹配。圖3b是經過質譜篩查獲得的嘧菌酯同位素峰286.366與母離子精確質量數285.363。圖3c統計母離子精確質量數下發生的ddMS2掃描情況，由此進一步獲得高能量碰撞情況下獲得的嘧菌酯保留時間二級質譜圖，由此得到圖3d的二級質譜碎片離子結果：69.799、87.187、158.227和188.274。

圖3 色譜圖與質譜圖Fig.3 Chromatogram and mass spectrum

根據以上篩查過程，定性篩查土壤樣品嘧菌酯殘留，篩查結果如表1所示。

表1 定性篩查結果Tab.1 Qualitative screening results

2.4 定量下限與線性范圍結果

土壤樣品中嘧菌酯濃度情況(線性范圍、定量下限、加標濃度差異下標準偏差與回收率)范圍如表2所示。

表2 濃度范圍Tab.2 Concentration range

按設定的色譜條件與質譜條件，使用高分辨質譜系統開展標準溶液分析，繪制得到的嘧菌酯標準曲線如圖4所示。

圖4 嘧菌酯標準曲線Fig.4 Standard curve of azoxystrobin

由圖4可知，在0.02～5.10 mg/L嘧菌酯濃度范圍，嘧菌酯標準濃度與峰面積之間存在較為均勻的線性關系。在色譜儀檢測條件下嘧菌酯最低檢出量標識為1×10-11g。依據10倍信噪比確定嘧菌酯定量下限為0.9 μg/kg。歐盟規定農藥的最低定量下限水平為10 μg/kg，本文篩查結果為0.9 μg/kg，說明該部分試驗中馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯符合最低報告水平。

2.5 嘧菌酯在馬鈴薯種植土壤中的消解動態

在馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯的消解動態情況如表3所示。

表3 馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯殘留消解動態Tab.3 Degradation dynamics of azoxystrobin residues in potato planting soil

由表3可知，馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯呈現緩慢消解狀態，施藥1 d嘧菌酯殘留量為0.526 6 mg/kg，當施藥天數達到120 d以后，嘧菌酯殘留量降至0.046 7 mg/kg，降解率為93.35%，半衰期約為33.87 d。土壤中嘧菌酯類農藥消解快慢情況受到氣候因素和土壤性質等多種外部因素影響，由表3可知，馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯消解速度較慢，符合一級動力學消解模式情況。

2.6 不同濃度嘧菌酯消解情況

不同嘧菌酯濃度與施藥次數下馬鈴薯種植土壤最終殘留情況如表4所示。

由表4可知，嘧菌酯濃度與施藥次數上升都會增加土壤中初始嘧菌酯殘留情況，隨著間隔時間的增長，殘留濃度也會適當下降，嘧菌酯施藥濃度越高，殘留量也就越高，因此實際種植時需要控制嘧菌酯的使用次數與使用濃度。而且實際種植時，考慮不同土壤與氣候特征影響，應該適當調整嘧菌酯用量。

表4 不同嘧菌酯濃度下殘留量統計結果Tab.4 Statistical results of residue under different azoxystrobin concentrations

3 結論

研究基于高分辨質譜法的馬鈴薯種植土壤嘧菌酯殘留快速篩查方法，使用高分辨質譜法結合四級桿串聯與高效液相色譜法篩查馬鈴薯種植土壤中的嘧菌酯殘留情況，對馬鈴薯種植土壤中嘧菌酯殘留開展定性和定量分析。經過試驗表明，高分辨質譜法能夠有效提取出嘧菌酯的詳細質量色譜圖，還能同時開展二級質譜碎裂，獲得比較準確的碎片質量數，經過試驗進一步研究還能獲得嘧菌酯隨著時間推移，嘧菌酯消解殘留情況，以及不同嘧菌酯濃度下消解殘留量，由此能夠看出，實際種植過程中適當調整嘧菌酯用量，不但不會造成過多的嘧菌酯殘留還能提升馬鈴薯摻量，降低病蟲害。