冠突曲霉flbD基因功能研究

余用秀，葛永怡，譚玉梅，王亞萍，邵 蕾，劉作易

(1.貴州大學生命科學學院/農業生物工程研究院，山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室，山地生態與農業生物工程協同創新中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生物技術研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州省農業生物技術重點實驗室，貴州 貴陽 550006；4.貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；5.貴州省農業科學院，貴州 貴陽 550006)

0 引言

冠突曲霉(Aspergilluscristatus)是茯茶上的優勢菌，又名“金花菌”?！敖鸹ň钡亩嗌俪１挥脕砼袛嘬虼u茶的品質[1]。本實驗室的前期研究發現，低滲條件下，該菌以有性發育為主；在高滲條件下，冠突曲霉以無性發育為主，并產生純的無性孢子[2]。因此，冠突曲霉是研究絲狀真菌產孢機制的好材料。

絲狀真菌的無性產孢是其進行繁殖的常見方式之一，在發育過程中受到了多個基因的精密調控。據報道，在模式菌構巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，brlA、abaA和wetA組成調控構巢曲霉無性發育的中心調控途徑，并決定無性產孢過程中基因激活的順序[3]。其中，brlA位于中心調控途徑的上游，該基因的激活是曲霉屬產孢的一個關鍵步驟，主要調控分生孢子梗形成分生孢子囊的過程[4]。fluG及flbA-E是中心調控途徑的上游發育激活因子，調控無性產孢的過程[5-8]。其中，flbD基因編碼Myb型DNA結合蛋白，它是激活brlA基因表達所需的關鍵轉錄因子，已在釀酒酵母、構巢曲霉、煙曲霉和稻瘟病菌等真菌中有過報道，發現它們對真菌分生孢子的形成至關重要[9-13]。冠突曲霉在茯磚茶上自然生長時，在實驗室低滲條件下培養時都以形成有性發育為主，這與大多數曲霉自然狀態下先形成無性發育不同。因此，探索flbD基因在冠突曲霉無性產孢過程的功能，對理解絲狀真菌的無性產孢機制具有重要意義。

目前，構巢曲霉(Aspergillusnidulans)及粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)做為模式生物開展的無性發育及無性產孢的分子調控機制研究較多，但國內外關于冠突曲霉無性產孢調控機制的報道幾乎沒有。因此，本研究擬以冠突曲霉(Aspergilluscristatus)為材料，期望能獲得flbD基因在該菌無性發育中的功能，并初步探究冠突曲霉與模式菌構巢曲霉flbD基因功能的異同。

1 材料與方法

1.1 菌株

本試驗所用的野生型冠突曲霉和根癌農桿菌AgrobacteriumtumefaciensLBA4404均來源于貴州省生物技術重點實驗室，大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態細胞購買于擎科生物有限公司，質粒pDHt/sk-hyg由中國科學院分子植物科學卓越創新中心王成樹研究員贈送。

1.2 試劑及培養基

普通瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒均購自OMEGA公司；潮霉素B、實時熒光試劑、卡鈉青霉素、氨芐青霉素鈉及限制性核酸內切酶等均購買于寶生物工程(大連)有限公司；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成；測序由擎科生物有限公司完成；基本培養基(MM)、誘導培養基(IM)、MYA培養基參考劉逸梅等[14]進行配制；其余生化試劑均為進口或國產分析純。

1.3 設計引物

根據Primer premier 5.0軟件設計試驗所需引物，如表1所示。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.4 重組敲除載體的構建及轉化根癌農桿菌

根據flbD基因及其上下游序列的特征，設計含有酶切位點XhoⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ的特異性引物，用于擴增flbD基因上﹑下游側翼序列，并將其酶切后、連接到pDHt/sk-hyg上，經驗證后得到敲除載體；采用凍融法將重組敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R轉化到根癌農桿菌感受態細胞，再運用PCR擴增后測序及雙酶切驗證。

1.5 敲除株ΔflbD篩選及PCR鑒定

對含有重組敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R的根癌農桿菌與野生型冠突曲霉分生孢子懸液(1×106個/mL)等體積混勻共培養，篩選轉化子，用特異性引物進行PCR后驗證。

1.6 敲除株ΔflbD拷貝數驗證

應用5倍梯度稀釋法，分別將野生型冠突曲霉基因組DNA和質粒pDHt/sk-hyg依次進行稀釋，通過擴增建立GAPDH和HYG的標準曲線。對于GAPDH和HYG的檢測，分別以ΔflbD、質粒pDHt/sk-hyg、野生型冠突曲霉和空白對照同時進行，每個樣重復3次，根據Pfaffl法計算ΔflbD的拷貝數[16]。

1.7 ΔflbD突變株表型觀察

在不同NaCl濃度的MYA培養基上，在28 ℃下培養野生型冠突曲霉和敲除株ΔflbD，應用顯微鏡觀察菌落表型和產孢情況。

2 結果與分析

2.1 重組敲除載體構建

運用擴增上下游同源臂的引物擴增flbD基因的上、下游同源臂，長度分別為585 bp(圖1a)和 857 bp(圖1b)。將上述擴增片段與質粒分別進行雙酶切，經驗證后用T4連接酶對已酶切完全的質粒pDHt/sk-hyg和flbD上、下游同源臂進行連接，連接后的質粒用XhoⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ分別對其進行酶切驗證，電泳檢測酶切的片段大小與預期一致，分別為9 317和585 bp、9 902和857 bp(圖2)，說明上、下游同源臂已經成功連接在質粒pDHt/sk-hyg上，重組敲除載體構建完成。

2.2 敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R轉化根癌農桿菌驗證

將重組敲除質粒L-pDHt/sk-hyg-R轉化到根癌農桿菌后，用特異性引物up-flbD-F and R、down-flbD-F and R進行質粒PCR驗證，初步篩選得到農桿菌陽性轉化子。再用XhoⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ對農桿菌陽性轉化子進行雙酶切驗證(圖3)，PCR擴增結果、酶切結果均與設計結果一致，說明重組敲除載體L-pDHt/sk-hyg-R已成功轉入農桿菌中。

注：M為DL2000 DNA Marker圖1 flbD基因上、下游同源臂PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of upstream and downstream homology arms of flbD

注：M為DL15000 DNA Marker；1和2為雙酶切結果；3為DL2000 DNA Marker圖2 flbD重組質粒L-pDHt/sk-hyg-R的雙酶切結果Fig.2 L-pDHt/sk-hyg-R was digested with double enzyme

注：M為DL15000 DNA Marker；1和2為雙酶切結果；3為DL2000 DNA Marker圖3 來自農桿菌的重組敲除載體雙酶切結果Fig.3 Results of recombination vector by double enzyme digestion

2.3 敲除株ΔflbD的PCR鑒定

根據引物設計方案(圖4)，利用跨潮霉素抗性基因hph的引物F1/R1進行擴增(圖5a)，野生型冠突曲霉擴增出2 115 bp的單一條帶；陽性敲除轉化子擴增出3 119 bp的單一條帶。以F2/R2進行擴增(圖5b)，野生型冠突曲霉擴增不出特異性條帶；陽性敲除轉化子擴增出2 114 bp的單一條帶；以F3/R3進行擴增(圖5c)，野生型冠突曲霉擴增不出特異性條帶；陽性敲除轉化子擴增出2 301 bp的單一條帶。結果表明，轉化子在預期位點發生同源重組，從而將目標基因敲除。

圖4 引物設計方案Fig.4 Project for designing primers

圖5 敲除株的PCR驗證結果Fig.5 PCR verification results of the mutant

2.4 敲除株ΔflbD拷貝數驗證

2.4.1 內源基因和外源基因標準曲線的建立

野生型冠突曲霉基因組DNA將作為內參標準品，含HYG基因的質粒pDHt/sk-hyg DNA作為外源標準品，通過實時熒光定量PCR擴增GAPDH和HYG的目標片段(圖6a和圖6b)，溶解曲線均為單鋒(圖6c和圖6d)，建立了5倍濃度梯度標準曲線(圖6e和圖6f)，GAPDH和HYG標準曲線的R2分別為0.999、0.997，擴增效率E值分別為0.933、0.963，擴增結果特異性好，可用于后續試驗。

圖6 內參基因和潮霉素基因片段的擴增、熔解曲線與標準曲線Fig.6 Amplification，melting and standard curves of GAPDH and HYG gene

2.4.2 目的基因拷貝數檢測

對于HYG和GAPDH的擴增，分別以△flbD﹑質粒pDHt/sk-hyg﹑野生型冠突曲霉和空白對照同時進行3次重復反應。從擴增曲線和溶解曲線可以看出，△flbD中HYG和GAPDH為特異性擴增，溶解曲線為單峰(圖7a和圖7b)；質粒pDHt/sk-hyg DNA作為GAPDH擴增的陰性對照，它的結果顯示無GAPDH的擴增；野生型冠突曲霉基因組DNA作為HYG擴增的陰性對照，它的結果顯示無HYG的擴增；同時，NTC(空白對照)無熒光信號。

圖7 △flbD中的GADPH及HYG的擴增曲線和溶解曲線Fig.7 Amplification and melting curves of the GADPH and HYG from knockout strains

根據Pfaffl法，當N=1時，可以推斷敲除菌株的拷貝數為1[16]。通過計算得到敲除株ΔflbD的N值接近于1，即敲除株拷貝數為單拷貝。

2.5 敲除菌株表型觀察

敲除菌株ΔflbD和野生型冠突曲霉的菌落觀察表型(圖8)。結果顯示：ΔflbD敲除株與野生型菌株的菌落直徑和色素均沒有明顯差異，但敲除株的菌落呈現蓬松狀，產生了大量“棉花”狀氣生菌絲，且菌落邊緣較稀疏。在3 M NaCl的MYA培養基上培養7 d，可以看到敲除株產生的分生孢子比野生型的少，并且敲除株的分生孢子主要集中形成于菌落中心。因此，采用馬躍等[17]的研究方法對含有1 mol/L和3 mol/L NaCl的MYA培養基上培養的野生型冠突曲霉與ΔflbD菌株進行分生孢子計數，結果表明野生型的分生孢子數量是敲除株的4.7倍，但子囊孢子的數量幾乎沒有變化(圖9)；其次，對野生型與敲除株的產孢結構的觀察結果顯示敲除株的分生孢子產孢結構的形成較野生型延遲(圖10)。這表明flbD基因對冠突曲霉無性發育及分生孢子的產生了正調控作用。

圖8 28 ℃培養野生型冠突曲霉(Aspergillus cristatus)與敲除株ΔflbD的菌落表型Fig.8 Phenotype of wild-type and ΔflbD strain of Aspergillus cristatus

圖9 敲除株ΔflbD和野生型冠突曲霉(Aspergillus cristatus)分生孢子和子囊孢子數量統計Fig.9 Statistics of conidia and ascospore from wild-type and ΔflbD strain of Aspergillus cristatus

3 討論

本研究采用根癌農桿菌介導的同源重組法對野生型冠突曲霉中flbD基因進行敲除，然后觀察flbD基因敲除株的形態變化，據此推測flbD基因在冠突曲霉發育過程中的功能。在構巢曲霉中，flbD基因是無性發育過程的重要調控因子之一，構巢曲霉中的flbD基因缺失后會導致分生孢子產生延遲及數量減少，并可能形成異常子實體[8-10]。

注：圖B，F(bar：20 μm)；C，E(bar：50 μm)。圖10 ΔflbD突變株與冠突曲霉(Aspergillus cristatus)野生型的觀察結果Fig.10 Observation results of wild type and ΔflbD strain from Aspergillus cristatus

本研究在獲得flbD敲除株的基礎上，通過觀察發現敲除株的分生孢子少于野生型，同時在含3M氯化鈉的培養基上，突變株分生孢子的產生有延遲現象，這與構巢曲霉的報道相一致[8-10]。同時，本研究結果與禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的flbD基因敲除株相比有明顯差異，禾谷鐮刀菌中flbD基因的缺失將阻止菌絲分化形成分生孢子梗和子囊殼，但冠突曲霉中flbD基因的缺失并不會阻斷其有性及無性產孢結構的形成[18]。

構巢曲霉的fluG、flbA、flbB、flbC、flbD和flbE基因是激活brlA基因所必須的，如構巢曲霉的研究顯示，flbE和flbB相互作用共同激活flbD，flbB又與激活的flbD以互作方式共同激活了brlA的轉錄[8]。據報道flb家族中的任何基因發生突變都會導致形成大量未分化的氣生菌絲，使菌落呈現“蓬松”或棉花狀外觀，最終使brlA表達量大大降低，課題組前期對該菌flbA敲除后也出現了類似的表型[7，19]。本文對冠突曲霉的flbD基因進行了敲除，其敲除株的菌落也呈現蓬松狀，同樣產生了大量的“棉花”狀氣生菌絲，并且其分生孢子數量顯著減少，這些現象與已報道的構巢曲霉相類似。因此，猜測冠突曲霉的flbD基因對該菌無性發育的調控方式可能與構巢曲霉類似。

4 結論

本研究通過同源重組獲得了flbD基因的敲除菌株，形態學觀察的結果表明冠突曲霉的flbD對該菌的無性產孢具有正調控作用，該基因的缺失將導致冠突曲霉分生孢子減少和產孢結構的形成延遲。本研究將有助于控制冠突曲霉的合適產孢方式和產孢量，從而可促進茯磚茶的產業化發展；同時將為絲狀真菌的無性發育研究提供借鑒。