漫談硼親和材料的進展與應用*

潘志恒，涂雪瑩

(佛山職業技術學院，廣東 佛山 528137)

近年來，硼親和材料可特異性吸附復雜基質樣品中的順式二羥基化合物，廣泛應用于糖蛋白、核苷酸、RNA等生物樣品的分離富集，這些生物分子對人類生命活動及臨床醫學具有非常重要的研究意義，因此本文對其研究進展進行總結和綜述，以便為科研工作者提供參考。

1 硼親和材料的作用原理

硼親和是基于酸堿條件下，硼酸和順式二羥基化合物發生可逆共價反應，作用原理如圖1所示，堿性條件下，硼原子與順式二羥基化合物發生共價結合，而在酸性溶液中，發生解離。

圖1 硼親和材料作用原理圖[1]

2 硼親和材料的發展

硼酸與順式二羥基化合物的結合反應早在1838年被發現，之后硼酸與各種糖醇和順式二醇的相互作用被更多的研究；1949年，Boeseken首次用硼酸測定碳水化合物的構型，發現在酸性環境下，很容易形成硼酸絡合物，紙層析分離顯色劑中加入硼酸，成功分離糖[2]；1959年，Lorand和Edwords研究了苯硼酸鹽水溶液離子與幾種多元醇的絡合平衡，證明了苯硼酸在堿性溶液中以sp3雜化的四面體存在[3]；1963年，Bourne等[4]證明了無環多羥基化合物在含有苯硼酸的溶劑中的RF值比它們衍生的醛糖或酮糖高得多，并提供了快速分離這類化合物對的方法。weith等[5]在1970年研究了含二羥基硼基纖維素衍生物的合成及其與糖和核酸形成絡合物的能力，并制成分離純化色譜柱，用于糖類和核酸的分離，此后硼親和材料得到迅速發展。2006年Hilder等[6]結合整體柱和硼親和材料的特點，研制了適合于微型硼酸鹽親和色譜的新型大孔整體固定相材料，大大擴大了硼親和的應用范圍。此后十多年時間里面，一系列具有獨特功能的硼親和材料被開發出來，包括硼親和納米材料、大孔整體柱、介孔材料、溫敏材料、硼親和分子印跡聚合物等，這些材料在代謝組學、糖組學和蛋白質組學等領域得到廣泛應用，極大拓寬了分離純化的對象，包括小分子化合物(類固醇、酮類、苷類、沙丁醇胺等)，大分子化合物(糖蛋白、多肽等)，基于硼親和相互作用的仿生分離介質在純化抗體和疾病特異性抗原等領域顯示了先天優勢。

3 硼親和材料的種類

3.1 大孔整體柱

大孔整體柱是由單體、交聯劑、引發劑和致孔劑的混合物在空柱管內原位聚合得到的連續多孔高聚物固體材料，材料表面可根據需要作相應的功能化衍生化，通過調整聚合單體的結構、比例、聚合溫度、時間等條件，可以制備具有不同孔徑及分布的功能性整體柱，以適應不同需求和分離模式，整體柱通常具有制備簡單、通透性好、柱壓低的特點[7]。研究者們結合整體柱和硼親和技術的優點，制備了各類硼親和整體柱，包括有機聚合物整體柱、有機無機雜化整體柱、分子印跡整體柱。

3.1.1 無機硅膠整體柱

無機整體柱相對于有機基質來說，硅膠無機硅膠整體柱在機械強度、耐高壓、化學穩定性等方面具有優勢，其表面豐富的硅羥基非常有利于化學基團進行表面修飾改性，可用于制作各種固定相，廣泛用于小分子的分離、純化和分析。但是，其pH值適用范圍比較窄，在堿性溶液中穩定性差。近年來有學者用金屬材料制作硼親和材料，金屬硼酸鹽具有獨特的結構類型，使其在傳統的微孔材料的催化、吸附、分離、熒光材料等領域都具有潛在的應用價值。

3.1.2 硼親和有機聚合物整體柱

制備有機聚合物整體柱的方法相對簡單，通常是將單體混合物及致孔劑注入到空管柱中，除氣泡，經熱、紫外光或者γ-射線引發使單體混合物聚合，得到連續多孔機物聚合物材料，這種材料的形狀是集成的，孔結構與其他色譜柱不同，可以使液體直接流過較大的介孔。其單體來源廣泛，制備簡單，可耐受更高的pH范圍和更高的溫度，具有良好的生物相容性。2006年，Hilder等[6]制備了第一批硼親和有機聚合物整體式柱，并利用液相色譜和毛細管電色譜有效分離了核苷類化合物。2009年，Liu等[8]研制了“一步法”制備硼親和有機聚合物整體柱，解決了后修飾方法的費時費力的缺陷。

3.1.3 有機無機雜化整體柱

有機聚合物整體柱雖然適用的pH值范圍比較廣(pH 1～14)，且容易制備，但是由于骨架是純有機化合物，剛性不足，耐熱穩定性低，不耐有機溶劑的溶脹作用，由此在一定程度上限制了其應用，而無機硅膠整體柱和有機聚合物整體柱相比，正好互補了其缺點，因此，為了克服有機聚合物整體柱的不足，新型的有機無機雜化整體柱由此而生。劉震等制備了一種獨特的硼親和雜化整體柱，其可在中性或者弱酸性條件下分離生物分子，如分離人尿中的腺苷[9]。

3.2 硼親和介孔材料

根據國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)的定義，多孔材料可以分為三種：微孔材料(孔徑<2 nm)、介孔材料(2 nm<孔徑<50 nm)和大孔材料(孔徑>50 nm)。介孔材料具有超高比表面積、大的孔容、可調控的孔尺寸和形貌特性，同時介孔材料的孔壁和孔道結構呈現出納米尺寸效應，被廣泛應用于樣品的分離和前處理，其中介孔硅材料較易于被硼親和修飾。硼親和介孔硅材料目前主要用于兩個方面，一是分離富集，二是藥物釋放。Xu等[10]在 2009 年首次制備了硼親和介孔材料，先用 γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO) 與 3-氨基苯硼酸反應，得到的產物再與介孔硅反應，該硼親和材料能夠用于糖肽的選擇性富集，這是第一次將介孔材料引入糖蛋白組學中來，與直接(傳統)分析相比，這種新方法使糖肽的檢測限提高了2個數量級。有機硼酸基團的無偏性質也使得該方法適用于所有類型的糖肽。

3.3 硼親和納米材料

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由它們作為基本單元構成的材料。目前，越來越多的納米材料作為吸附劑提高有效成分的提取率。磁性納米材料具有易分離、表面改性、吸附能力強、生物相容性好等特點，在樣品預處理、分離純化等方面得到了廣泛的應用。硼親和磁性納米材料對于分離純化順式二羥基化合物具有明顯優勢，但是其與糖蛋白的結合力普遍較弱，因此很難分離富集低含量的糖蛋白。劉震等利用多位點協同作用，合成了具有協同作用的樹枝狀硼親和磁性納米材料(dBA-MNPs)，其與糖蛋白的親和力比普通的材料相比，提高了1000～10000倍，可以用于分離濃度低至2×10-14mol/Ld 糖蛋白[11]。

3.4 硼親和分子印跡聚合物

分子印跡技術又叫做分子印記技術、分子烙印技術或分子模板技術，是一種新興的分子識別技術，其目的是制備對模板分子具有特異選擇性識別能力的聚合物，即分子印跡聚合物(MIPs)。由于該技術具有預定性、可識別性和實用性等特點，在很多領域(如色譜分離、固相萃取、仿生傳感、模擬酶催化、臨床藥物分析等)中得到了廣泛的應用。劉震等提出了制備糖蛋白的分子印跡聚合物的通用方法，并發展制備了糖蛋白的分子印跡聚合物圖案化陣列的軟光刻方法。該方法由于采用了快速的光聚合法避免了蛋白質構象的變化[12]。在此基礎上，其又提出了基于硼親和作用的可控定向表面印跡法，不僅可以制備二維陣列，還可以制備分子印跡整體柱[13]。

3.5 硼親和溫敏材料

Roohi等[14]采用偶氮引發劑改性的介孔二氧化硅微球，通過可逆加成-斷裂鏈轉移(RAFT)介導的聚合反應，接枝溫度敏感聚合物(聚-N-異丙基丙烯酰胺，PNIPAAM)。該材料對五種疏水類固醇的分離是有效的，當柱溫高于PNIPAAM的最低臨界溶液溫度時，保留時間和分離效率都隨著柱溫的升高而提高。Li等[15]的研究表明 2，4-二氟-3-甲酰基苯硼酸(DFFPBA)具有超高的硼酸與單糖的結合親和力，而且具有適當間隔臂的單體對小分子量的順式二醇具有較低的結合pH值(6.0)，這些優點使得DFFPBA功能化整體柱適合于在中性和弱酸性真實樣品中富集痕量順式二醇類化合物。Lu等[16]報道了一種pH值調控策略，用于微調硼親和整體柱對兩類糖蛋白的特異性，即唾液酸化和非唾液酸化糖蛋白。

4 硼親和納米材料的應用

4.1 對糖蛋白的分離富集應用

很早之前，人們就已經利用硼親和色譜材料對順式二羥基化合物進行分離純化，主要是糖類及一些糖蛋白。硼親和配體在堿性條件下可以與順式二羥基分子結合，形成穩定的五元環或者六元環，而在酸性環境下，可逆的解離釋放出順式二羥基分子。因此，在糖類、糖蛋白及兒茶酚物質的分析檢測方面，相對與凝集素親和色譜、親水作用色譜等其他方法，具有簡單便捷高效的優勢。隨著糖蛋白組學的發展，糖蛋白的分離檢測越來越具有重要意義。糖蛋白在生物體內發揮至關重要的勝利作用，許多疾病的發生與蛋白質糖基化有關，如在腫瘤發生的過程中，會產生不同水平蛋白質糖基化。但是體內糖蛋白的含量水平是非常低的，而且存在于成分復雜的生理體液當中，濃度高的蛋白對于糖蛋白的檢測產生了嚴重的干擾和信號掩蓋等問題，因此必須采取必要的手段對糖蛋白進行富集，其中硼親和材料的應用是最廣泛的，而且在不斷發展。Song等首次在金電極的表面修飾了硼酸基團，并用于血漿樣品中糖基化血紅蛋白的檢測[17]。電化學檢測手段屬于在線檢測，工序簡便省時，周期短，也為糖蛋白的檢測提供了發展的空間。

4.2 對糖的分離富集應用

血糖監測對于臨床診斷、控制和治療糖尿病是至關重要的，基于硼親和的電化學葡萄糖傳感器對糖尿病患者在臨床上的血糖水平檢測具有很好的應用前景，如柏占明構建了基于硼親和作用的夾心型葡萄糖電化學傳感器，能夠在 0.5～20.0 mM的范圍較好的檢測糖原水平[18]。

4.3 對核苷的分離富集應用

核苷是核酸的主要組分，一些核苷及其衍生物具有重要的生理功能，例如，肌苷可以治療急慢性肝炎和風濕性心臟病。許歡歡采用表面引發-可逆加成-斷裂鏈轉移聚合(SI-RAFT)技術，制備了一種高吸附容量、吸附動力快、選擇性高的的新型硼酸親和吸附劑用于血清樣品中核苷的分離富集，檢測出小牛血清中尿苷和鳥苷的含量分別為(170±1.6) ng/mL 和(39.6±4.4) ng/mL[19]。

4.4 對兒茶酚胺的分離富集應用

兒茶酚胺是一種含有兒茶酚和胺基的神經類物質，越來越多的證據表明它們在疾病的發生和發展中發揮著不同的作用。許多學者對兒茶酚胺進行了研究，現階段最重要的研究目標是如何快速準確地檢測目標物質。Ozdemir等將氨基苯硼酸鍵合在氯甲基化的樹脂球上，制備了3-氨基苯基硼酸功能化聚(3-氯-2-羥丙基甲基丙烯酸酯)(APBA功能化聚(HPMA-Cl))微球，用于兒茶酷胺的分離，通過實驗結果表明，APBA功能化聚(HPMA-Cl)微球是一種很有前途的兒茶酚胺吸附劑[20]。

4.5 藥物分析檢測和傳遞的應用

藥物檢測由于生物樣品中干擾比較多，所以樣品的處理就尤為重要，王薇等采用硅膠為基質，通過原子轉移自由基聚合(ATRP)的方法合成了一種新型高容量硼酸吸附劑，在目標物質與干擾物質摩爾比為 1:50和1:100時，含有順式鄰二醇的藥物均能被有效的萃取出來[21]。

4.6 核酸適配體篩選應用

核酸適配體是一小段經體外篩選得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能與相應的配體進行強特異性的穩定結合，它主要是借由一種被稱為SELEX法德人工篩選程序產生的，它已經成為蛋白質組學、代謝組學、藥物研發等領域的重要研究工具。適配體靶標范圍廣，靶標的大小與可溶性均不同，因此應用 SELEX 技術篩選核酸適配體可以采用不同的具體操作方法。Ma Yanyan等作首次提出基于硼親和分子印跡技術的適配體篩選新方法用于糖蛋白核酸適配體篩選[22]。該方法以甘氨酸印跡磁性納米粒(MNPs)作為與靶糖蛋白結合的親和力界面，并將靶糖蛋白結合MNPs作為適體選擇的親和力子，然后將目標糖蛋白結合的MNPs作為親和底物進行適體選擇，該方法快速、高效、特異性強，而且大大降低了陰性篩選的概率。

5 結 語

硼親和材料作為獨特的親和色譜技術，由于蛋白質組學和代謝組學的需要，在近十多年里迎來了一個快速發展階段。目前的硼親和材料突破了常規硼親和材料只能用于堿性pH環境的限制，適用的pH范圍擴大中等酸性環境，覆蓋了常見的生理樣品pH范圍，因此大大擴寬了其在糖蛋白疾病標志物識別等領域的應用，同時，多位點協同作用可以有效解決硼親和材料親和力若的缺點，展現了硼親和材料在仿生分離介質方面的美好前景。隨著一些基本問題的解決，硼親和材料將會在復雜生物樣品分離純化中有更大的發展空間和更廣闊的應用。