CoCl2誘導低氧對奶牛胎盤滋養層細胞活性的作用

張真豪，袁夢儀，付博凡，高玉平，肖龍菲，倪和民，郭凱軍，蘇 月，安 紅，王相國*

(1.北京農學院 動物科學技術學院，北京 102206；2. 北京市昌平區動物疫病預防控制中心，北京 102206；3.天津市薊州區下倉鎮人民政府，天津 301905)

在不同生物體和組織器官中，低氧應答結果對機體的影響具有兩面性[1]。由于妊娠初期滋養層細胞浸潤程度淺，胚胎與母體之間物質交流建立不完整，螺旋動脈尚未重塑，胎盤滋養層細胞未完成轉化而形成完整的血管系統，使該階段胎盤組織處于相對低氧環境中[2-4]。

以往關于低氧對人和小鼠的胎盤滋養層細胞影響的研究表明，滋養層細胞功能受PLGF調節。PLGF作為血管內皮生長因子之一，能促進血管生成并調節內皮細胞增殖[5]，但其對滋養層細胞的調控作用受滋養層細胞局部微環境影響[6]。PLGF缺失或抑制雖然能減少新血管產生，但不影響血管的發育[7]。體外試驗發現，PLGF通過作用于微血管內皮細胞與臍靜脈內皮細胞，促進其遷移與增殖[8]。研究證實，PLGF能使內皮細胞中DNA合成顯著上升，誘導內皮細胞激活[9]。在早孕期，胎盤絨毛內合體滋養細胞中的PLGFmRNA表達較強，但在孕晚期胎盤血管合體膜中的PLGFmRNA表達最豐富[7]。為了調節內皮細胞功能、增強胎盤血氧供給，滋養層細胞合成大量PLGF[10,11]。目前，低氧對人類胎盤滋養層細胞生長發育的影響已有相關報道，但關于低氧對奶牛胎盤滋養層細胞影響還少見報道。就此系統研究了低氧狀態對奶牛胎盤滋養層細胞造成的一系列影響，旨在為奶牛胎盤發育研究提供試驗依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗動物細胞：奶牛胎盤滋養層細胞系(hTERT-BTC)由北京農學院動物科學技術學院動物育種與輔助生殖團隊前期構建[12]并保存。

胎牛血清：杭州四季青公司。逆轉錄試劑盒cDNA KIT、熒光定量試劑盒SYBR均為日本Toyobo公司。BCA蛋白定量檢測試劑盒：北京Leagene公司。DMEM/F12培養基：美國Hyclone公司。兔抗人hTERT單克隆抗體和兔抗人E-Cahderin單克隆抗體為美國Abcam公司。轉染試劑Lipofectamine2000為美國Invitrogen公司。引物合成：上海生工公司。CO2恒溫培養箱314819-1280美國Thermo公司，熒光定量PCR儀G8830A美國ABI公司，凝膠成像儀721BR09549美國AlphaInotech公司，B2型生物安全柜BCM-1300A蘇州安泰空氣技術有限公司，高速臺式低溫離心機ALLEGRA-64R德國Eppendorf公司。

1.2 建立CoCl2誘導的細胞低氧模型

將奶牛胎盤滋養層細胞接種于24孔板，培養至細胞密度達到70%～80%，加入0、50、100、150、200、250 μg/mL的CoCl2篩選培養基，培養基每3 d更換1次，觀察細胞生長狀態，重復3次。利用Western Blot檢測缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達情況。

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測PLGFmRNA表達量 利用Trizol法提取常氧組(0 μg/mL CoCl2)、低氧組(200 μg/mL CoCl2)胎盤滋養層細胞系中RNA，每組3個重復，反轉錄cDNA。以cDNA為模板，交由上海生工設計引物。表1是引物序列。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

PCR擴增體系為：10×buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，MgCl21.5 μL，TapDNA聚合酶0.25 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，ddH2O 14.75 μL，cDNA 1 μL；反應程序為：95 ℃預變性5 min，按95 ℃下反應30 s、56 ℃下反應30 s、72 ℃下反應60 s循環反應30次，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2 顯微鏡觀察 胎盤滋養層細胞鋪滿六孔板后，設置常氧組(0 μg/mL CoCl2)、低氧組(200 μg/mL CoCl2)各3個孔，均處理24 h后，用10 μL槍頭按照標記線做劃痕，每個孔3條劃痕，用PBS沖洗，4%多聚甲醛孵育固定10 min，固定后用PBS清洗2次，用結晶紫染色液染色10 min，用PBS緩沖液清洗殘留染色液，置于顯微鏡下觀察，隨機選取6個鏡下視野，拍照。每組試驗重復3次。

按3∶1的比例將Matrigel基底膠(培養基與槍頭用4 ℃預冷處理)與不含血清的DMEM/F12培養基進行稀釋處理，在Transwell小室濾膜中按50 μL/孔的劑量加入Matrigel基底膠，在37 ℃培養箱中恒溫孵育30 min，收集2×104個經200 μg/mL CoCl2處理24 h的奶牛胎盤滋養層細胞，將Transwell上室用Matrigel包被，加入200 μL無血清DMEM/F12培養基重懸后的細胞，在下室中加入500 μL的DMEM/F12完全培養基(含10%胎牛血清)，放入含有5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養24 h；取出Transwell小室，將濾膜上方的上室內的細胞和基質膠用棉簽輕輕擦去，再用PBS緩沖液沖洗干凈，用4%多聚甲醛將小室包裹孵育，固定穿過濾膜的細胞10 min，用PBS緩沖液清洗2次，用結晶紫染色液染色10 min，再用PBS緩沖液清洗殘留染色液，干燥后將小室濾膜下室面朝上，置于顯微鏡下觀察，鏡下隨機選取6個視野，拍照。每組試驗重復3次。

1.2.3 Western Blot檢測 將低氧處理細胞和未處理細胞(作為陽性對照)中的總蛋白分別提取出來。采用BCA法測定樣品蛋白質濃度。制備SDS-PAGE膠(由12%分離膠和5%濃縮膠組成)，將膠板放入電泳槽內，浸泡于電泳液中；在點樣孔內加入蛋白Marker與蛋白樣品，接通電源并設置80 V電壓電泳20 min后轉為100 V電壓繼續電泳45 min；觀察蛋白Marker達到分離要求后，將膠板取出浸泡于轉膜液中，在轉膜液中切下大小合適含有目的條帶的膠條并按照正極板、海綿墊、濾紙、PVDF膜、膠、濾紙、海綿墊和負極板的順序放置轉膜夾，在電泳槽內加入預冷好的轉膜液與冰盒，放入轉膜夾，將電泳槽放入盛有冰塊的盆中，100 V電壓轉膜75 min；轉膜結束之后，室溫下將轉好的PVDF膜放入5%脫脂奶粉內，于搖床上緩慢搖動封閉1～2 h；用5%脫脂奶粉配制E-Cadherin抗體(一抗)，將封閉結束后的PVDF膜放入一抗內并放在4 ℃冰箱內孵育，過夜；一抗孵育結束后用含0.1% Tween20的PBS緩沖液洗滌5次，每次15 min；然后將PVDF膜放入HRP標記的二抗中于搖床上室溫孵育1～2 h；二抗孵育完畢后，將PVDF膜用PBST緩沖液洗滌5次，即可滴加ECL化學發光劑混合液，進行暗室X-射線膠片顯影。

采用SPSS 18.0分析軟件對數據進行顯著性檢驗，采用t檢驗方法對相關數據進行統計學處理。P<0.05視為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 最適CoCl2濃度

HIF-1α是細胞在低氧條件下出現的低氧應答蛋白，其含量會隨氧分壓變化而變化，以此作為篩選依據。圖1 顯示，不同濃度的CoCl2誘導表達的HIF-1α量不同，呈現出隨著CoCl2濃度的升高而顯著升高的趨勢(P<0.05)。因此，以CoCl2濃度為200 μg/mL作為后續建立模型的濃度。

M:蛋白Marker; 1～5: 0、100、150、200、250 μg/mL CoCl2M: Protein Marker; 1-5: 0, 100, 150, 200, 250 μg/mL CoCl2圖1 不同CoCl2濃度下HIF-1α的表達情況Fig.1 The expression of HIF-1α under different concentrations of CoCl2

2.2 低氧對胎盤滋養層細胞形態、遷移及浸潤的影響

圖2顯示，常氧環境下的胎盤滋養層細胞分布均勻且密集，細胞形態正常，細胞分裂能力較強，生長狀態良好，能夠清楚地觀察到細胞偽足及合胞體。低氧環境下的滋養層細胞密度下降，數量明顯減少，滋養層細胞增殖緩慢，偽足數量減少，同時合胞體數量減少，細胞形態出現不同的改變。

圖2 低氧條件下滋養層細胞形態、遷移及浸潤變化情況Fig.2 Changes in trophoblast morphology, migration and infiltration of trophoblast cells under hypoxia

常氧狀態下的滋養層細胞在遷移過程中分布均勻，遷移細胞狀態良好；但在低氧環境下的胎盤滋養層細胞表現出明顯的遷移減緩，遷移率下降，分布不均勻并且有明顯的空白區域。

常氧狀態下的滋養層細胞浸潤能力強，細胞數量多，密度大，細胞形態飽滿，狀態良好。低氧環境下的胎盤滋養層細胞在Transwell小室中穿梭數量減少，表現出明顯的浸潤率下降。

2.3 低氧條件下PLGF mRNA表達

胎盤生長因子(PLGF)作為胎盤生長發育主要的影響因子，在胎盤滋養層細胞增殖分化過程中起著重要作用，并對細胞生理功能具有顯著影響。圖3結果顯示，常氧條件與低氧條件下PLGFmRNA的表達量無顯著差異(P>0.05)，說明PLGFmRNA的表達不受氧分壓變化的影響。

圖3 常氧與低氧條件下 hTERT-BTC中PLGF mRNA的表達情況Fig.3 Expression of PLGF mRNA in hTERT-BTC under normoxia and hypoxia conditions

2.4 低氧條件下E-Cadherin表達

圖4顯示，E-Cadherin的表達量在低氧環境下表現出顯著下降趨勢(P<0.05)，說明低氧環境會使E-Cadherin表達量減少。

圖4 常氧與低氧條件下hTERT-BTC中E-Cadherin的表達情況Fig.4 Expression of E-Cadherin in hTERT-BTC under normoxia and hypoxia conditions

3 討 論

氧氣是細胞生長發育的必要條件之一，是細胞的必要營養素。氧氣含量過高或過低都會引起機體的適應性反應，有研究表明子宮內氧濃度能夠調節并影響胎盤的結構和功能[13]。在人類胎盤的研究過程中，人們對缺氧的作用有著不同的見解[14]。HIF-1α是細胞內表達的低氧標志物，本研究通過Western Blot檢測HIF-1α在胞內的表達變化來篩選CoCl2濃度，并以此建立細胞體外低氧模型。有研究比較了兩種常用的低氧模型誘導劑CoCl2與DMOG，結果顯示，200 μM CoCl2可明顯引起HIF-1α的靶基因Glut1的表達增加，但對Vegfα無明顯影響；500 μM的DMOG則對Glut1和Vegfα均有明顯影響[15]。說明CoCl2與DMOG均可用于建立體外低氧模型，但誘導低氧的作用機制或產生程度有所不同，從而使下游基因表達情況也出現不同趨勢。

有研究表明，低氧可以促進人胎盤滋養層細胞增殖和遷移[16]。而對于反芻動物，我們的試驗結果顯示，低氧環境下的胎盤滋養層細胞增殖緩慢，密度下降。這種結果的差異可能與試驗對象的種族或發育狀態有關[17]。胎盤滋養層細胞由于其特殊性，本身具有遷移、侵襲功能，在胚胎著床后完成與子宮內膜上皮細胞的接觸與融合，并進一步遷移、浸潤完成胎盤血管系統的建立[2]。本研究的結果顯示，在低氧環境中，細胞出現明顯的遷移減緩、遷移率下降、浸潤率降低等滋養層細胞功能衰退的現象。研究表明，胎盤滋養層細胞侵襲、分化的能力受損可能與不明原因的自然流產有關[18]。

胎盤生長因子(PLGF)作為影響胎盤生長發育的主要因子，對胎盤滋養層細胞的生長發育具有重要作用，其通過自分泌或(和)旁分泌方式對自身及周圍細胞均有不同程度的作用[19]。Fumihito Nishimoto等[20]通過CoCl2誘導獲得低氧環境，對來自于人胎盤分離出的原代滋養層細胞進行實時PCR擴增和ELISA試驗，發現在低氧環境下PLGFmRNA的表達水平顯著降低，但是HIF-1α不改變PLGFmRNA的表達。對于以奶牛為代表的反芻動物，試驗結果顯示，PLGFmRNA的表達不受氧分壓變化的影響，推測低氧環境下，各因子對其的影響主要作用于蛋白質翻譯過程，這為后續研究提供了新的方向。

E-Cadherin是上皮細胞表達的特殊表面黏附分子，可作為上皮細胞形態特征的重要參考因子，胎盤滋養層細胞作為上皮樣細胞，E-Cadherin在其發育轉化過程中具有重要意義，尤其表現在涉及胎盤血管生成的生理過程。有研究結果表明，低氧通過HIF-1α誘導Snail上調，從而導致E-Cadherin表達量下降[21]，本研究結果與此相吻合。低氧環境導致的E-Cadherin蛋白表達減少可能與細胞形態變化、偽足減少等有關。

總之，本研究利用CoCl2成功構建了奶牛胎盤滋養層細胞低氧模型，利用該模型系統的研究了低氧狀態對于奶牛胎盤滋養層細胞造成的一系列影響，為探究奶牛胎盤早期發育奠定理論基礎。