冷凍脫脂HPLC測定食用植物油中4種多環芳烴

潘曉玉，趙逸涵，王宗義，劉方征，高婧怡，趙修平，王雨萱，何世慧

(北京農學院 食品科學與工程學院/食品質量與安全北京實驗室/農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206 )

PAHs的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-5]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[6-7]、液相色譜-串聯質譜法[8]和氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[9]等。其中HPLC、GC-MS較為普及，GC-MS/MS的選擇性則更優。但無論何種檢測方法，就食用植物油而言，脫除油脂的干擾都是檢測PAHs的關鍵。固相萃取柱[10]、分子印跡色譜柱[11]和凝膠滲透色譜[12]等技術，都有較好的除脂效果，但成本相對高或依賴專用設備。冷凍除脂是一種成本低、操作簡單的方法[13]，對簡化食用植物油樣品處理，是較為實用的方法之一。該研究通過優化冷凍除脂方法，結合HPLC分離和熒光檢測器(FLD)的高靈敏性，建立了食用植物油中PAH4的檢測新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和材料

LC-20AD 液相色譜儀、RF-10AXL 熒光檢測器(日本島津公司)；PAH專用色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國 Waters 公司)；5810R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；BCD-272WDGD 冰箱(中國海爾公司)；RE-2000A 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)、BF-2000氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)；MS 3 basic 渦旋混勻器(德國IKA公司)；0.22 μm尼龍微孔濾膜(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 取0.5 g (精確至 0.01 g)食用油樣品于50 mL離心管中，加入16 mL乙腈-水(15∶1)，2 000 r/min渦旋5 min，4 000 r/min 離心5 min，于冰箱中冷凍(-20 ℃)2 h，使下部油脂層凝固，迅速將乙腈提取液傾倒至雞心瓶中，下層油脂重復以上步驟，再次提取1次，合并提取液至雞心瓶中，40 ℃旋蒸至干，加入1 mL乙腈渦旋復溶，吸取復溶后溶液過0.22 μm濾膜于進樣瓶中，待測。

1.2.2 標準溶液的配制 將2 000 mg/L多環芳烴標準混合溶液用二氯甲烷稀釋，得到200 mg/L的混合標準儲備溶液；混合標準儲備液用乙腈稀釋獲得1 mg/L的多環芳烴中間工作溶液，于棕色貯液瓶中-20 ℃貯藏(用前放置到室溫)。用乙腈稀釋中間工作溶液，得到1、5、10、20、50和100 μg/L的標準工作溶液，用于標準曲線繪制。

1.2.3 儀器分析條件 色譜柱：Waters PAH C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：超純水(A)-乙腈(B)；流速1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。梯度洗脫程序：0.01～5.00 min: A保持50%，B保持50%; 5.00～20.00 min: A從50%下降到0%，B從50%上升到100%；20.00～28.00 min:A保持0%，B保持100%；28～32 min:A從0%上升到50%，B從100%下降到50%；32～36 min:A保持50%，B保持50%。熒光檢測參數：BaA的保留時間為22.079 min，激發波長為270 nm，發射波長為385 nm；CHr的保留時間為22.799 min，激發波長為270 nm，發射波長為385 nm；BbF的保留時間為24.417 min，激發波長為256 nm，發射波長為446 nm；BaP的保留時間為26.279 min，激發波長為292 nm，發射波長為410 nm。

1.2.4 方法學考察 按1.2.1的樣品處理方法大豆油進行樣品處理，上機檢測觀測目標物色譜峰的干擾情況，對選擇性進行評價；通過校正曲線方程的R2值，評價方法的線性；樣品基質中，以目標物色譜峰3倍信噪比和10倍信噪比分別計算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)；參照樣品中目標物的實際濃度進行3水平6重復的加標回收率試驗，計算回收率和相對標準偏差，對準確度和精密度進行評價，其中最低加標水平大于目標物實際含量水平的二分之一。

2 結果與分析

2.1 冷凍除脂條件的優化

食用植物油經乙腈提取后，部分油脂會溶解在乙腈中，干擾色譜分離的檢測，需要進行脫除。研究表明，食用油加乙腈渦旋、離心后，經超低溫冷凍使油脂固化，并立即轉移提取液，可有效去除其中的油脂，且當提取液乙腈中加入少量水的條件下(乙腈水的體積比為15∶1)，效果更佳[14]。本試驗使用普通冰箱，延長冷凍時間至2 h，可以使脂肪全部凍住，從而轉移全部的乙腈提取液，且試驗結果表明，經本試驗的冷凍脫脂處理，可用于HPLC測定。由于本試驗使用的是熒光檢測器，穩定同位素內標不能發揮作用，因此，提取冷凍2次，合并提取液進行處理，從而達到提高提取效率的目的。

2.2 方法學考察

由典型色譜圖(圖1)可見，采用PAH專用色譜柱，PAH4在大豆油樣品基質中獲得有效分離，圖1為食用大豆油樣品未曾加標及其加標10 μg/kg PAH4后的色譜圖，根據圖1，表明該方法選擇性良好，可以實現4種物質的分離。

A.大豆油原樣 B.加PAH4 10 μg/kg；1:BaA；2:CHr；3:BbF；4:BaP圖1 PAH4分離的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of PAH4

通過對系列標準溶液進樣分析，得到校正曲線方程見表 1，在1～100 μg/L的考察范圍內，PAH4線性良好，R2>0.999 7。由于樣品中4種目標物的本底值很高，空白樣不易獲得，不能采用空白加標的方法評價LOD、LOQ，因此采用實際樣品中分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的評估LOD和LOQ，亦列于表 1, PAH4的LOD和LOQ分別為0.06～0.32 μg/kg和0.19～1.07 μg/kg，遠低于食用油中PAH4的關注濃度。

表1 方法學驗證Tab.1 Methodological validation

2.3 回收率與精密度

由于常見食用植物油的樣品基質較為相近，本試驗以大豆油為代表進行3水平加標回收試驗，每個水平做6個重復，計算方法回收率和相對標準偏差(RSD)。由于食用油樣品中PAH4有較高的本底，定量限水平的加標濃度不能獲得，故設最低加標質量濃度為10 μg/kg。試驗結果見表 2，總體日內回收率為77.09%～96.00%，RSD為3.65%～11.75%。回收率滿足GB/T 27417—2017[15]要求，當濃度水平范圍為小于0.1 mg/kg時，回收率范圍為60%～120%。

應用本方法檢測市售稻米油、玉米油、花生油、大豆油，每種類型各取2個不同廠家，每家樣品重復測量2次，檢測結果列于表 3。結果顯示，BaP含量在1.00～3.20 μg/kg，PAH4為1.92～20.58 μg/kg。

表3 食用油中PAH4的檢測結果Tab.3 Determination results of PAH4 in edible plant oils

3 討 論

該研究建立了冷凍脫脂-高效液相色譜法測定食用植物油中PAH4的新方法。該方法具有樣品處理相對簡單、成本低的特點，減少了對專用設備的依賴，滿足一般試驗室檢測的需要，具有普遍適用性；冷凍脫脂盡管脫脂不是十分徹底，但能夠滿足HPLC分析的需要，通過使用并定期更換色譜分離預柱方法，能夠有效避免樣品對色譜柱的污染，從而實現對檢測方法的簡化；該方法檢出限、準確度均能夠滿足食用油中PAH4監測的需要。實際樣品檢測顯示，中國食用植物油中PAH4污染有一定食品安全風險，值得持續關注。