異養硝化好氧反硝化菌研究進展

慕 浩，王亞娥，李 杰,2，胡凱耀，朱紅娟，易宏學，張莉紅,2,3

(1.蘭州交通大學 環境與市政工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省非常規水資源化利用技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅省膜科學技術研究院有限公司，甘肅 蘭州 730020)

1 引言

氮素是引起水體富營養化的主要原因之一，傳統脫氮工藝應有相應的缺氧、好氧生物反應器或通過間歇曝氣等手段控制反應器內溶解氧量，來達到生物脫氮的目的。然而，反應器占地面積大、回流管道多、需額外投加堿度是目前污水處理廠所面臨的瓶頸，因此如何從廢水中高效脫氮且減少處理成本是污水處理廠的焦點問題。

同步硝化反硝化(SND)有占地小、運行管理方便等優勢，擁有良好的發展前景[1]。目前存在3種理論解釋SND，即宏觀環境、微環境和微生物學理論[2]。宏觀環境理論認為反應器內氧擴散不均勻，引起局部好氧、缺氧環境進而實現SND。微環境理論認為，由于氧傳質過程具有阻力，使活性污泥外部呈好氧態，內部呈缺氧態，以此實現SND。Robertson等[3]分離出的第一株HN-AD菌Thiosphaerapantotropha，從微生物學角度闡明了實現SND的機理。

區別于自養硝化和缺氧反硝化，異養硝化指微生物利用水中有機物將氨氮轉化為亞硝氮和硝氮的過程，而好氧反硝化則是在好氧條件下進行的反硝化過程，HN-AD菌就是一類既擁有異養硝化功能又擁有好氧反硝化功能的微生物。常見的HN-AD菌主要是革蘭氏陰性菌，主要屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[4]、產堿桿菌屬(Alcaligenessp.)[5]、副球菌屬(Paracoccussp.)[6]、不動桿菌屬(Acinetobactersp.)[7]、無色桿菌屬(Achromobacterdenitrificanssp.)[8]等。部分真菌也具有HN-ND功能，如楊曉華[9]分離出的Fusariumsp.A60可在氨氮或硝氮作為唯一氮源下生長，并且具有良好的脫氮效率。

目前對HN-AD菌的研究大多停留在實驗室階段，很難應用于實際，因為HN-AD菌直接投加至廢水中易于流失，難以成為優勢菌種[10]。本文對HN-AD菌的影響因子、相關酶系等方面進行了綜述，并且對未來HN-AD菌的研究方向進行了展望。

2 HN-AD菌生長及脫氮效果的影響因子

影響HN-AD菌生長及脫氮效果的因素眾多，其中研究較為廣泛的是碳源種類、C/N比、溫度和酸堿度。部分HN-AD菌最佳參數及脫氮性能見表1。

表1 部分HN-AD菌最佳參數及脫氮性能

2.1 碳源種類

HN-AD菌可以利用多種有機碳源，如檸檬酸鹽、乙酸鈉、丁二酸鈉、琥珀酸鈉、蔗糖、乙醇等。不同碳源會不同程度地影響HN-AD菌，這反映在不同的O2利用量、N2O產生量和亞硝酸鹽積累量上[11]。據報道[12]，檸檬酸鹽作為碳源時，Alcaligenes faecalis strain WT14脫氮效率最高，原因可能是檸檬酸鹽分子結構簡單，檸檬酸根離子可以直接參與菌體的三羧酸循環，更有利于脫氮。N2O是一種常見的溫室氣體，大部分HN-AD菌最終反硝化產物為N2O而不是N2，因此如何減少N2O產生量廣泛受學者關注。

此外，來自石油、制藥、焦化等行業產生的難降解有機物對傳統硝化反硝化菌有生物毒害作用，導致其生長及脫氮機能受抑制。而一些HN-AD菌卻可以利用一些難降解有機物作為碳源。如Lu Hong等[13]分離出的Rhodococcus pyridinivorans GF3可降解9種蒽醌類物質。Bai Yaohui等[14]分離出的Shinella zoogloeoides BC026可以以吡啶為唯一碳、氮源對其進行降解。而Pseudomonas sp. BC001[15]以喹啉為碳、氮源，可完成對有機物和氮素的去除。

2.2 C/N比

C/N比會顯著影響細菌的生長及脫氮效果。低C/N比不能為細胞生長和反硝化提供足夠的能量和電子供體，同時，過高的C/N比可能會抑制細菌的生長繁殖[16]。由于HN-AD菌種類繁多且代謝機理不同，此類菌對C/N比的適應范圍較廣，大多數HN-AD菌適宜的C/N比在10左右，高于傳統硝化、反硝化菌[17～19]。Pseudomonas stutzeri strain XL-2[19]在C/N比為10時脫氮效率最高，可去除97.9%的硝酸鹽氮； Sang Chiguo等[20]分離的Bacillus sp. SC16在C/N比為8時降解效率最高。

由于HN-AD菌所需C/N比普遍較高，難以處理低C/N比廢水，這是異養硝化-好氧反硝化脫氮所面臨的挑戰之一。Huang Tinglin等[21]從飲用水蓄水池分離出的Pseudomonas stutzeri strain ZF31在C/N比為3時對總氮去除率達到73.30%。篩選耐低C/N比的菌株是當前研究的熱點。

2.3 溫度和pH值

溫度和pH值對HN-AD菌生長、繁殖起重要影響，不適于細菌生長的溫度、pH值會導致菌體酶的活性降低，甚至死亡。大多數HN-AD菌的最適溫度范圍為25～37 ℃，最適pH值范圍為7.0～7.5[22～24]。Zhu Liang等[25]篩選出的Pseudomonasmendocina3-7最適溫度為30 ℃，當溫度下降到10 ℃時，其總氮去除率由原來的89.9%降為9.4%。Pseudomonasmandelii[26]在pH值為5的條件下，好氧反硝化相關酶的活性大大降低。然而，一些HN-AD菌可在極端溫度和pH值條件下生長繁殖并且對氮素進行去除。李振輪[27～29]等分離出的PseudomonasmonteiliiStrainH97、PseudomonasputidaY-12、ArthrobacterarilaitensisY-10均可以在15℃的條件下保持良好的脫氮效果。其中PseudomonasmonteiliiStrainH97在pH值為12.0時，對硝氮和總氮的去除率仍有64.75%和36.78%，為一株耐冷嗜堿HN-AD菌。Jingrui Yang等[30]篩選出的Acinetobactersp. JR1在pH值為4.5時仍具有良好的脫氮效果。從極端環境下篩選分離耐高低溫、耐酸堿的菌株也是目前的研究熱點之一，根據我國廢水處理實際情況，耐低溫菌株具有更好的應用前景。

3 HN-AD菌相關酶系及氮代謝途徑

截至目前，已分離的HN-AD菌分屬于不同屬、種，菌株的多樣性導致研究其代謝途徑和機理相對困難，因此其詳盡的代謝途徑及機理尚不明確。目前的研究主要集中于分析相關酶系及測定脫氮中間、最終產物來推測其脫氮途徑。

3.1 相關酶系

參與異養硝化過程的酶有氨單加氧酶(AMO)、羥胺氧化酶(HAO)和亞硝酸鹽氧化還原酶(NXR)。而硝酸鹽還原酶(NR)、亞硝酸鹽還原酶(NIR)、一氧化氮還原酶(NOR)和一氧化二氮還原酶(NOS)則參與好氧反硝化過程。HAO為異養硝化過程的關鍵酶，NR和NIR為好氧反硝化過程的關鍵酶。其詳細作用原理見圖1。

圖1 參與好氧反硝化過程的酶作用原理

羥胺氧化酶(HAO)是一種周質酶，不同的菌種可能會純化出不同類型的HAO，如從Bacillussp. K5[36]中純化出的HAO與Acinetobactersp. Y16[37]純化出的HAO在大小、最大速率、最適溫度、最佳pH值等方面均不同。目前學者[38]對自養硝化菌的HAO有詳細研究，但對異養硝化菌的HAO卻缺乏詳細研究。異養菌的HAO不含血紅素，酶的活性可被Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)顯著促進[39]，這說明在異養硝化體系中加入鐵離子可能會促進HAO活性，從而提高硝化效率。

硝酸鹽還原酶(NR)進一步可分為異化硝酸鹽還原酶(NRs)、同化硝酸鹽還原酶(Nas)和真核硝酸鹽還原酶(eukNR)[40]。Nas參與細菌同化作用，eukNR存在于真核生物中，在此不做討論。NR分為周質硝酸鹽還原酶(Nap)和膜結合硝酸鹽還原酶(Nar)。Nap可在好氧條件下表達，因此通常測定Nap的活性來判斷細菌是否具有好氧反硝化特性。Nap是一種異二聚體酶，含有一個催化亞單位(NapA)和一個電子轉移亞單位(NapB)。NapA是大亞基，含有兩個氧化還原活性中心：鉬活性中心和鐵硫簇。NapB是小亞基，含c型細胞色素，是生物體中電子傳遞的一個重要組成部分[39, 40]。

亞硝酸鹽還原酶(NIR)有兩種：Cytcd1型亞硝酸鹽還原酶，編碼基因為nirS；Cu型亞硝酸鹽還原酶，其編碼基因為nirK[41]。這兩種類型的亞硝酸鹽還原酶均可在好氧反硝化過程中起重要作用，但一般不同時出現在同一菌株當中[42]。據報道：PseudomonasaeruginosaATCC 9027[43]和PseudomonasstutzeriX31[44]依賴nirS編碼的酶進行亞硝酸鹽還原反應，從Ochrobactrumanthropi和Alcaligenesfaecalis中則擴增出了nirK編碼基因[45]。

3.2 氮代謝途徑

為達到同步硝化反硝化脫氮，微生物體必須擁有硝化和反硝化的相關酶。目前已經提出2種可能的氮代謝途徑來解釋異養硝化-好氧反硝化過程。

第一種途徑為氨氮被氧化成羥胺，隨后羥胺被氧化成亞硝氮和硝氮，而硝氮(亞硝氮)又逐漸被還原成氮氣的過程。此途徑中硝化反應的相關酶AMO和HAO可被檢測，反硝化反應的相關酶NR、NIR也可被檢測。如PseudomonasalcaliphilaAD-28[46]中，AMO和HAO的酶活力分別為0.112 U/mL和0.012 U/mL，NR和NIR的酶活力為0.108 U/mL和0.043 U/mL。

第二種途徑是通過中間體羥胺將氨氮直接轉化成為含氮氣體的過程。如Hungsoo Joo等[22]發現在好氧條件下，AlcaligenesfaecalisNo.4中檢測不到反硝化相關酶的存在，推測最終生成的N2O可能是由銨氧化產生的羥胺生成。Zhao Bin等[47,48]的研究成果更進一步的證明了此觀點。AcinetobactercalcoaceticusHNR[47]在好氧條件下既沒有NR也沒有NIR被檢測到。然而，其HAO的酶活力為0.051 U/mL，AlcaligenesfaecalisstrainNR[48]中HAO酶活力則高達0.063 U/mL，同時檢測不出反硝化相關酶。這表明銨氧化產生的羥胺在HAO酶的作用下直接轉化成了N2O等氣態產物，該途徑將脫氮過程大大簡化，對氮循環和廢水處理具有重要意義。

4 展望

HN-AD菌在SND體系中具有重要意義，目前學者們的主要研究方向為該類菌株的分離、鑒定和影響因素的探究，未來的研究方向應該側重于以下幾個方面。

(1)把單一的HN-AD菌和其他菌株復合或通過微生物固定化等技術，來提高其在實際應用中的穩定性。

(2)HN-AD菌所需的C/N比普遍較高，處理低C/N比廢水困難，因此篩選最佳C/N比較低的菌株具有重要意義。

(3) HN-AD菌脫氮最終產物大多為N2O，而N2O是導致溫室效應的主要原因之一，因此如何減少N2O的產生量也是未來研究熱點之一。