基于人工基質(zhì)的著生藻類測定方法探討

嚴(yán) 飛，朱冰川，徐 賧

(江蘇省無錫環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 無錫 214000)

1 引言

河流水質(zhì)主要從理化指標(biāo)、水生生物、生境狀況等角度評價[1]?，F(xiàn)有環(huán)境下物理和化學(xué)監(jiān)測技術(shù)已經(jīng)較為成熟，對污染物已經(jīng)可以進(jìn)行快速完善的測定，但環(huán)境中的污染物并非單獨存在，環(huán)境受到污染后的影響非常復(fù)雜也難以進(jìn)行快速鑒定，因此根據(jù)水生生物對水體污染快速反應(yīng)的特點，可以進(jìn)行水環(huán)境污染的及時預(yù)警。水生生物的研究近年來越發(fā)重要，河流中藻類主要分為著生藻和浮游藻兩大類,著生藻類是水體中的初級生產(chǎn)者[2]。著生藻類是生長在水下各種基質(zhì)表面上的所有藻類[3]，是水生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分[4]，但著生藻類的研究報道較少[5]。著生藻類生物完整性指數(shù)的水生態(tài)健康評價技術(shù)在國外得到廣泛應(yīng)用[6]。

著生基質(zhì)是研究著生藻類工作的基本材質(zhì)，按照采樣基質(zhì)的不同，對著生藻類的研究可以分為天然基質(zhì)法和人工基質(zhì)法。天然基質(zhì)法是指采集位于水下的鵝卵石、碎石、高等水生植物、大型藻類、枯枝落葉等，并從其上刮取著生藻類，或用培養(yǎng)皿扣去河床上細(xì)沙、沉積物得到藻類的方法到藻類的方法[7]。受天然基質(zhì)的局限性,對著生藻類的深入研究有限，而人工基質(zhì)主要有載玻片、瓷磚、人工水草等[8]，本文以標(biāo)準(zhǔn)面積和可知時間的人工基質(zhì)探討著生藻類的測定。由于對人工基質(zhì)尚未有統(tǒng)一的使用標(biāo)準(zhǔn),本次實驗主要對著生藻類的定性、定量監(jiān)測結(jié)果以及精密性等進(jìn)行分析探討，對樣品處理和鑒定計數(shù)采用常規(guī)制片法(非硅藻樣品)和改進(jìn)的計數(shù)方法[9]。

2 方法原理

利用人工基質(zhì)(放置一段時間，讓藻類能附著生長)和天然基質(zhì)采集水中著生藻類，對采集的樣品進(jìn)行固定、濃縮，抽取樣品在顯微鏡下進(jìn)行著生藻類的定性和定量，其中通過生物個體計數(shù)來表征單位面積藻類個體數(shù)量(藻類密度)，利用形態(tài)學(xué)對物種進(jìn)行定性鑒定。

3 儀器設(shè)備、試劑和材料

3.1 設(shè)備器材

毛刷、鑷子、刀片、剪刀、樣品瓶(250 mL)、標(biāo)簽紙、丙烯酸纜繩、硅藻計(由本中心提供技術(shù)參數(shù)進(jìn)行定制，載玻片尺寸2.5 cm×7.7 cm，一共8 片，總面積為300 cm2，無站內(nèi)編號)，配備10×目鏡和20×、40×、100×(油鏡)物鏡的生物顯微鏡(型號：NIKON80i，站內(nèi)編號：AGS001，校準(zhǔn)日期：2018年6月11日，有效期為1 年，檢定校準(zhǔn)證書見附件10)，載玻片及蓋玻片、浮游生物計數(shù)框、移液槍、一次性槍頭、記號筆、膠頭滴管、乳膠手套及一般實驗室常用儀器和設(shè)備。

3.2試劑藥品

(1)固定劑。魯哥氏液：40 g碘(含量≥99.8%，分析純)溶于含碘化鉀(含量≥99.0%，分析純)60 g的1000 mL水溶液中；福爾馬林：市售40%的甲醛溶液(甲醛含量37.0%～40.0%，分析純)。

(2)實驗用水。蒸餾水：新制備的超純水。

4 樣品的采集與保存

本次方法確認(rèn)于2019年3月12日在梁南橋點位開始放置人工基質(zhì)(硅藻計)1 個，每天查看，以確保硅藻計不丟失。3月26日收集樣品(人工基質(zhì)定性、定量樣品1個，天然基質(zhì)定性樣品1個)，共計2個(采樣記錄見表1)。

表1 采樣記錄

4.1 樣品采集

4.1.1 定量樣品—人工基質(zhì)法

本次實驗采用人工基質(zhì)硅藻計，在河流采樣中避開急流和漩渦，采樣時固定好器材，保證硅藻計距離水面5～10 cm，使之得到合適的光照，每天觀察了解采樣器材放置情況，在放置14 d后進(jìn)行著生藻類的采集，采集過程中將硅藻計從水中緩慢移出，用毛刷和刀片將載玻片表面上所有附著的著生藻類全部刮到盛有蒸餾水的玻璃瓶中，并用蒸餾水將基質(zhì)沖洗多次，用魯哥氏液固定，貼上標(biāo)簽。此次方法確認(rèn)采用直接加入魯哥氏液固定來定量鑒定著生藻類。

4.1.2 定性樣品—天然基質(zhì)法

采集天然基質(zhì)上的著生藻類樣品，本次實驗中采集基質(zhì)為卵石(85%)、樹木殘干(15%)，采集過程中將基質(zhì)從水中緩慢移出，將表面相對較為光滑和略帶綠色、藍(lán)綠色或棕黃色的部分用刀片刮取到裝有少量蒸餾水的樣品瓶中。將所有采集到的樣品混合裝入樣品瓶中，加入甲醛溶液，貼上臨時標(biāo)簽。

4.2 樣品固定和保存

(1)定性樣品固定：按100∶3的比例在樣品中加入市售的甲醛溶液。

(2)定量樣品固定：按100∶1.5的比例在樣品中加入配好的魯哥氏液，鑒定完成后按定性樣品固定液的比例加入甲醛溶液永久保存。

(3)將樣品放入密封的樣品瓶中，置于統(tǒng)一的樣品柜中保存。

4.3 標(biāo)識與記錄

(1)標(biāo)識。在樣品瓶上粘貼標(biāo)簽，標(biāo)注采樣地點、日期、采集人姓名、固定液類型。在樣品記錄本上記錄與樣品編號相對應(yīng)的采樣地點、日期與樣品類型。

(2)記錄。在著生藻類采樣記錄表中記錄河流名稱、采樣位置、采樣日期、采集人姓名、采樣方法及相關(guān)生態(tài)信息。采樣完成后，在著生藻類樣品登記表上記錄樣品信息(表2)。

表2 著生藻類樣品登記

5 樣品前處理和鑒定

5.1 樣品的處理和制備

5.1.1 定性樣品

常規(guī)制片法：將采集到的定性樣品根據(jù)個體密度適當(dāng)沉淀、濃縮至適宜體積，觀察時，將樣品充分搖晃均勻后，靜置5～10 s，用膠頭滴管吸取液體中間略偏下位置的樣品滴放在載玻片上，制成臨時裝片。

5.1.2 定量樣品

將采集到的樣品濃縮、沉淀后，定容至20～50 mL(根據(jù)樣品中生物的密度確定定容體積)。本次實驗濃縮沉淀至50 mL。

5.2 鑒定和計數(shù)

所有樣品鑒定過程中參考《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)》[10]。

5.2.1 定性樣品

將5.1.1 中制備的臨時裝片置于10×40 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、鑒定和粗略計數(shù)。

5.2.2 定量樣品

將5.1.2 中制備的濃縮樣品充分搖晃均勻后，取0.1 mL置于浮游生物計數(shù)框中，在10×40 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、鑒定和計數(shù)。

5.2.3 計數(shù)方法

本實驗采用改進(jìn)的計數(shù)方法：對計數(shù)框中的樣品按照對角線的格進(jìn)行計數(shù)，每0.1 mL計數(shù)10個小格，重復(fù)計數(shù)3個0.1 mL，共計30 小格。

著生藻類每片個數(shù)計算公式：

N=100×m/30

(1)

式(1)中：N為每片藻類個體數(shù)，ind；m為30 小格總個體數(shù)量(鏡檢生物個體數(shù))，ind；30 為30 個小格；100 為計數(shù)框全片格數(shù)為100 個。

著生藻類個體數(shù)量(藻類密度)計算公式：

n=niV/ViS

(2)

式(2)中：n為單位面積藻類個體數(shù)量，ind/cm2；ni為抽樣的總個體數(shù)量，ind；V為定容總體積，mL；Vi為抽樣體積，mL；S為采樣的總面積，cm2，本次實驗采樣總面積為300 cm2。

6 實驗結(jié)果

本次方法確認(rèn)的實驗時間：2019年3月12日至4月2日，實驗室分析結(jié)果分述如下。

6.1 天然基質(zhì)定性監(jiān)測結(jié)果

定性樣品鑒定計數(shù)結(jié)果見表3。

表3 著生藻類—天然基質(zhì)定性樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計

6.2 人工基質(zhì)定性、定量樣品定性、定量樣品

數(shù)據(jù)鑒定計數(shù)結(jié)果見表4和表5。

表4 著生藻類—定量樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計表一

表5 著生藻類—定量樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計表二

6.3 精密性

由于生物監(jiān)測的特殊性，本實驗中主要針對定量樣品進(jìn)行精密性檢查，通過以下兩方面來表征。

6.3.1 平行性

由同一分析人員在相同實驗條件下對同一樣品做平行分析，評估兩次實驗數(shù)據(jù)差異，兩片計數(shù)結(jié)果個數(shù)相差不超過15%(平行樣A見圖5，平行樣B見圖6)。由表1可知，平行樣個數(shù)計數(shù)結(jié)果相對差(相對差=兩片計數(shù)結(jié)果差值/兩片計數(shù)結(jié)果中的較小值×100)為4.7%，符合“兩片計數(shù)結(jié)果個數(shù)相差不超過15%”的要求[9](表6)。

表6 精密性檢查(平行性)

6.3.2 重復(fù)性

統(tǒng)一樣品、統(tǒng)一方法、統(tǒng)一分類鑒定參考文獻(xiàn)，做不同分析人員比對實驗，評估兩組實驗數(shù)據(jù)差異，兩片計數(shù)結(jié)果個數(shù)相差不超過15%。由表2可知，人員比對藻類個數(shù)計數(shù)結(jié)果相對差(同上)為7.8%，符合“兩片計數(shù)結(jié)果個數(shù)相差不超過15%”的要求(表7)。

表7 精密性檢查(重復(fù)性)

7 討論

本次實驗，探討了人工基質(zhì)用于河流中著生藻類監(jiān)測的可行性，并使用該方法對梁塘河梁南橋斷面著生藻類進(jìn)行了監(jiān)測，從實驗結(jié)果來看，在著生藻類定性方面，采用人工基質(zhì)監(jiān)測結(jié)果與天然基質(zhì)基本一致，藻種鑒定結(jié)果一致性達(dá)到95%；在著生藻類定量方面，經(jīng)過精密性檢查，平行性符合“兩片計數(shù)結(jié)果個數(shù)相差不超過15%”的要求，重復(fù)性符合“兩片計數(shù)結(jié)果個數(shù)相差不超過15%”的要求。

總體來看，人工基質(zhì)比天然基質(zhì)在河流著生藻類監(jiān)測方面有以下優(yōu)勢：①人工基質(zhì)比天然基質(zhì)外觀更規(guī)整，沒有復(fù)雜結(jié)構(gòu)，更容易觀測分析；②人工基質(zhì)比天然基質(zhì)更具有普及性，可以統(tǒng)一基質(zhì)的材質(zhì)并且對不同水體、流域進(jìn)行橫向?qū)Ρ纫约巴凰w的不同深度縱向?qū)Ρ龋虎廴斯せ|(zhì)更易使藻類附著，并且可以在天然基質(zhì)無法出現(xiàn)的更深水體中放置，開展更多開創(chuàng)性研究；④人工基質(zhì)比天然基質(zhì)更易保存，防止由于類似木材生物質(zhì)離開水體后的氧化腐爛對藻類產(chǎn)生影響。由此可見，用人工基質(zhì)取代天然基質(zhì)對河流著生藻類進(jìn)行監(jiān)測具有可行性，在今后實際工作中可以嘗試采用人工基質(zhì)開展監(jiān)測。為繼續(xù)更深層次的著生藻類研究、水污染預(yù)警研究、和水生生物指示劑的研究提供鋪墊和引導(dǎo)作用。