基于網絡藥理學的葛根降糖機制研究

舒建中 李穎慧 蒲雨晴 劉慶靈 張 娟 甘玉立 謝永芳▲

1.重慶市中醫院腦病科，重慶 400021；2.重慶郵電大學生物信息學院，重慶 400065

葛根為多年生草質藤本植物[1]，內含有葛根素、大豆黃酮苷等豐富的黃酮類化合物，還有蛋白質氨基酸、糖和人體必需的鐵、鈣、銅、硒等礦物質，藥用價值極高[2]。本研究利用網絡藥理學，期望從成分-靶點-通路進行整體預測，并闡明葛根在體內的作用機制，選取葛根基本成分，結合靶點功能以及通路對蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡進行聚類，探討相關顯著的作用模塊及每個模塊的關鍵基因，并期望構建PPI 網絡以及基因本體（gene ontology，GO）功能、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，旨在分析其靶點以及信號通路，對葛根成分小分子及其作用靶點的結合潛力進行探究，以明確其與靶點的結合潛力，為最終構建“化合物-靶點-信號通路”網絡奠定基礎。本研究預期通過對葛根化學成分的網絡藥理學分析尋找葛根發揮作用的關鍵成分、靶點及作用通路，探討其多靶點多通路協同作用機制，期望能為葛根的開發應用奠定基礎。

1 方法

1.1 化合物成分及靶點分析

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP）數據庫收集中草藥的組分和分子結構、關鍵ADME（吸收、分布、代謝和排泄）參數、成分作用靶點等關鍵信息[3]。通過TCMSP 數據庫，查詢葛根主要成分，并篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30、類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18 的小分子，研究其作用方式。獲得小分子的Chem ID，在Pubchem 數據庫中找到其對應smile 序列，若無對應靶點信息的成分，利用MOE 軟件，使用swiss target prediction 網站獲得其成分靶點信息[4]。

1.2 構建PPI 網絡及化合物-靶點-信號通路網絡

使用STRING 在線軟件進行PPI 網絡的構建與分析，以預測靶點之間的相互作用，并通過metascape獲得靶點的相關富集通路和功能注釋，并對靶點進行聚類并篩選關鍵靶點，通過cytoscape 對所得信息進行整理構建化合物-靶點-信號通路網絡。

1.3 關鍵靶點及分子對接驗證

對獲得的關鍵靶點進行驗證，利用MOE 軟件進行分子對接，通過其結合能力從空間結構匹配和能量匹配來驗證其結合機制。觀察pose 數量、pose 之間的最佳得分以及偏離原配體程度（root-mean-square deviation，RMSD）值[3-4]。

根據經驗使用PDB（protein data bank）數據庫搜索含有小分子配體，且配體結構更接近對接藥物的小分子結構，選擇口袋和共晶配體完整的結構和分辨率高的晶體結構[5-6]。

2 結果

2.1 化合物成分及靶點分析結果

通過對葛根化學成分的篩選，共獲得4 種滿足OB＞30、DL＞0.18 的小分子，它們可能是潛在的活性成分。本實驗分析材料為除葛根素的四種符合篩選條件的葛根主要成分：芒柄花黃素（formononetin）、谷甾醇（β-sitosterol）、3′-甲氧基大豆苷元（3′-methoxydaidzein）、大豆苷元-4′,7-二葡萄糖苷（daidzein-4′,7-digluco side）、葛根素（puerarin）。最終獲得106 個相關靶點的基因信息（gene symbol）來進行后續分析。葛根成分的部分靶點信息見表1。

表1 葛根成分的部分靶點信息

2.2 構建PPI 網絡

從STRING 網站上傳葛根相關靶點構建PPI 網絡關系數據，獲得相關GO 分子功能118 條及細胞組分注釋及KEGG 通路注釋51 條。利用metascape 根據基因gene symbol 富集到的通路和生物學過程，來分群和構建PPI 網絡。挑選出富集程度較高的gene，注釋相關性，構建PPI 網絡。圖1A（封三）表示富集到的基因關聯性網絡；圖1B（封三）為基因富集程度網絡；圖2A（封三）顯示PPI 網絡，可以觀察到不同基因的作用關系；圖2B（封三）顯示其中主要的幾個模塊及其基因數量。

圖1 metascape 富集結果

圖2 PPI 網絡

2.3 構建“化合物-靶點-信號通路-功能”網絡

將“2.2”項中的PPI 數據與通路和生物學過程富集數據相結合，可得三類基因模塊及代表基因（表2）；其中模塊1 包括CYP17A1、HSP90AB1、CYP19A1、CYP51A1、CYP2C19、CYP1B1；模塊2 有NR3C1、PPARG、AR、TNF、NR1H3、ESR1；HTR2C、PTGER1、HTR2A 屬于模塊3。

表2 各模塊高分代表基因

圖3（封四）繪制出了所有靶點相關的“化合物-靶點-信號通路-功能”，結果顯示，網絡中既存在一個分子與多個靶點蛋白的相互作用關系，也存在不同分子作用于同一個靶蛋白的現象，顯示出多成分多靶點多通路特點，一定程度上也暗示葛根可能在多種疾病上均可發揮作用。

圖3 “化合物-靶點-信號通路-功能”關系圖

2.4 關鍵靶點及分子對接驗證

選取每組打分最高的基因靶點CYP17A1、NR3C1、HTR2C，進行分子對接驗證。在PDB 數據庫中查找符合條件的PDB 結構，即靶點蛋白的三維結構，得到CYP17A1（P05093）的靶點蛋白，其PDB ID為5IRQ，對應結合的藥物小分子為β-谷甾醇；NR3C1（P04150）在PDB 數據庫中查找得到的對應靶點蛋白的PDB ID 為4UDD，對應小分子為β-谷甾醇；在PDB 數據庫中查找到得到HTR2C（P28335）的對應靶點蛋白的PDB ID 為6BQH，對應小分子為芒柄花黃素和3′-甲氧基大豆黃素。運行MOE 軟件，分別進行分子對接，對接打分結果見表3，對接圖見圖4（封三）。其中S值表示一系列的小分子與蛋白質的對接pose 中的得分最佳的，通常S 值越負，對接情況越好；由于PDB 結構中下載的蛋白質結構中含有小配體，因此，可以通過藥物小分子與原配體的疊合能力來預測小分子與靶點蛋白的結合能力，而配體與小分子的疊合能力由RMSD值來衡量，其中RMSD值越小，表示該小分子與靶點蛋白具有良好的結合潛力。表3 結果顯示，β-谷甾醇與ID 為4UDD 的靶點蛋白結合能力以及與原配體的疊合能力較好。

表3 各對接情況打分表

圖4 靶點與藥物分子對接

3 討論

3.1 三個模塊的降糖作用分析

目前一般認為糖尿病發病機制與胰島素分泌和/或胰島素作用缺陷有關[7-8]，有研究表明，含葛根的湯劑配合西醫常規治療對2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）濕熱證患者血糖有明顯改善作用[9]。模塊1 包括CYP17A1（1.141432）、HSP90AB1、CYP19A1（1.141419）、CYP51A1、CYP2C19、CYP1B1，該模塊五個基因主要富集到類固醇代謝途徑[9]。類固醇激素及其受體主要參與真核基因表達的調節，并影響靶組織中的細胞增殖和分化。其中CYP1B1，細胞色素P450 1B1。細胞色素P450 是一組血紅素硫醇單加氧酶[10]。在肝微粒體中，該酶參與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴性電子轉運途徑[11-12]。它會氧化類固醇、脂肪酸、類維生素A 等。模塊2 包括NR3C1、PPARG、AR、TNF、NR1H3、ESR1 主要功能富集在類固醇激素反應以及類固醇介導的信號通路。PPARG 是過氧化物酶體增殖物激活受體γ；結合過氧化物酶體增殖物（如降血脂藥和脂肪酸）的核受體。一旦被配體激活，核受體就會與DNA 特異的PPAR 反應元件結合并調節其靶基因（如酰基輔酶A 氧化酶）的轉錄，控制了脂肪酸的過氧化物酶體β-氧化途徑，是脂肪細胞分化和葡萄糖穩態的關鍵調節器[13-14]。ARF6 充當組織特異性脂肪細胞P2（adipocyte P2，aP2）增強子的關鍵調節劑[15]。PTGER1 是前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）受體EP1 亞型，該受體的活性由激活磷脂酰肌醇鈣第二信使系統的G（q）蛋白介導，可能是腎臟功能的重要調節劑，涉及各種組織中對PGE2的平滑肌收縮反應，分析與腸胃蠕動消化調節有關。模塊三包括HTR2C、PTGER1、HTR2A 主要功能富集在鈣信號通路以及磷脂酰肌醇生物合成過程。

3.2 相關基因與降糖途徑分析

CYP17A1 是細胞色素P450 家族17 亞家族A 成員，可催化17-α-羥基化和17,20-裂合酶反應，對于雄激素和糖皮質激素的產生都是必不可少的。有實驗證明，肝臟CYP17A1 在糖異生中的作用是通過其下游產物17-OHP 激活糖皮質激素受體轉錄活性，使糖異生的關鍵酶基因的轉錄上調，從而促進了糖異生的過程[16-17]。皮質醇是主要的內源性糖皮質激素，它影響多種生理功能，例如脂質和葡萄糖代謝，代謝穩態和對壓力的適應性。皮質醇的生產主要受促性腺激素中促腎上腺皮質激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）的調節。ACTH 對皮質醇合成的刺激作用取決于cAMP 依賴性信號傳導，但也涉及膜去極化和胞漿Ca2+增加。cAMP 和Ca2+各自誘導StAR 的表達，刺激線粒體內膽固醇的轉移，以及從膽固醇到皮質醇的途徑中的類固醇生成酶（例如CHE、CYP17A1、CYP11B1）[16]。

NR3C1 是糖皮質激素受體，具有轉錄抑制活性。NR3C1 是應激反應系統的關鍵組成部分。糖皮質激素對糖代謝具有干擾作用，與胰島素的降糖有拮抗作用，是胰島素反調節激素，糖皮質激素過多可能會導致繼發性糖尿病[17-18]。有研究表明，糖皮質激素可以應用到某種糖尿病患者的臨床治療中，可以有效控制炎癥反應、減少血糖波動[19-20]。

HTR2C 是G 蛋白偶聯的5-羥色胺受體，有研究表明，基因HTR2C 與高血糖、神經系統疾病以及免疫代謝等方面有關[21]。

綜上所述，通過構建葛根多成分-靶點-信號通路，并對靶點基因功能和代謝通路進行分析，借助網絡藥理學的思路解釋葛根降血糖的可能作用機制。文中預測的靶點與已知的藥理作用相吻合，說明靶點預測的準確性，獲得其主要靶點有三個，分別為CYP17A1、NR3C1 和HTR2C，揭示了葛根作用的多成分、多靶點、整合調節作用特點。