肺泡微結石癥1例家系基因分析

胡秋芳 張 娟 盛天昕 楊小東 陳司漢

1.樂山職業技術學院醫護系，四川樂山 614000；2.四川省德陽市人民醫院呼吸內科，四川德陽 618000；3.四川大學華西醫院呼吸內科，四川成都 614000

肺泡微結石癥是（pulmonary alveolar microlithiasis，PAM）以兩肺肺泡內鈣、磷微小結石沉積及繼發肺間質纖維化改變為特征的一種罕見肺部疾病。該病有家族遺傳傾向，多以常染色體隱性方式遺傳，其發病與SLC34A2（solute carrier family 34 member 2）基因突變有關[1]。該基因編碼Na 依賴的Pi 轉運蛋白NaPi-Ⅱb，該蛋白主要表達于肺泡Ⅱ型上皮細胞，主要作用是從肺泡液中吸收無機磷用于肺泡表面活性物質的合成。SLC34A2 基因突變后使NaPi-Ⅱb 蛋白質形成異常，導致肺泡內鈣磷轉運失調，無機磷積累，進而引發磷酸鈣鹽沉積[2-3]。隨著近年來對該病認識的增加，至今為止已有30 種不同的SLC34A2 基因變異被報道[3]。我國報道的SLC34A2 基因突變多為外顯子8 突變[4]。現報道1例PAM 患者的SLC34A2 基因突變特點。

1 病例資料

1.1 一般資料

患者男，30 歲，自幼常因“感冒”于當地醫院就診，行胸片檢查考慮“肺結核”，未進一步檢查及規律抗結核治療，一般予以輸液治療幾天后癥狀緩解。3年前患者反復出現咳嗽、咳痰，活動及感冒后感氣緊，行胸部CT 檢查提示雙肺彌漫顆粒狀結節影，余無特殊。患者父母無近親關系，家系中父親所有弟弟均未婚，父親妹妹與母親弟弟結婚，第三代包括先證者共4 人（家系圖譜見圖1）。其他家系成員無類似癥狀。

圖1 病例家系系譜圖

1.2 體格檢查

查體：體重62 kg，身高168 cm，唇無發紺，無杵狀指，心界正常，心律齊，各瓣膜區未聞及雜音。雙肺呼吸音稍低，未聞及干濕啰音，雙下肢無水腫。

1.3 輔助檢查

血鈣：2.07 mmol/L，肺功能：①FVC 為4.01 L（與預計值之比為87.9%）；②FEV1為13.76 L（預計值之比為97.4%）；③FEV1/FVC 為94%；④BR 輕度降低，DLCO 中度下降，VEDA＞10 L；⑤患者彌散功能中度降低，通氣儲備功能輕度下降，過度通氣，肺功能中度受損。胸部CT 檢查提示：雙肺彌漫高密度結節影，以中下肺為主，呈“暴風雪”或“沙暴”樣改變，提示肺泡微結石癥；雙肺間質改變，雙肺胸膜增厚、粘連、鈣化；縱膈淋巴結增大（圖2）。在排除粟粒型肺結核、塵肺、肺含鐵血黃素沉著癥等疾病，根據患者病史、典型臨床表現及實驗室檢查結果，擬診為PAM。

圖2 患者胸部CT 肺窗及縱膈窗

1.4 基因檢測資料

經知情同意后，患者及在世家族4 名成員均用乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管抽取外周靜脈血4 ml，DNA 提取采用基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。DNA抽提后用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測純度及含量。對SLC34A2 基因13 個外顯子中的12 個外顯子設計引物進行PCR 擴增，將PCR 擴增產物送至上海生工生物公司進行測序分析。首先檢測患者12 個外顯子的編碼區和剪接位點的突變，確定可能的突變位點，然后針對突變位點再檢測突變在其家族成員中的分布情況。另取100 例無關正常人外周血DNA 作為對照。

1.4.1 PCR 擴增結果 SLC34A2 基因2-13 號外顯子成功擴增（圖3）。

圖3 SLC34A2 基因2-13 號外顯子擴增產物

1.4.2 基因檢測結果 該PAM 家系成員基因經雙向測序發現，患者SLC34A2 基因突變為外顯子8 突變c.910A＞T（p.K304X）（圖4）；SNP 位點有2 個突變即內含子12 的rs199563183 (p.Y455H)（圖5）和外顯子13 的rs3733545（圖6）同時出現突變。其父親外顯子8 c.910A＞T（p.K304X）存在突變，母親SNP 位點也有以上2 個突變。家系中患者舅舅無突變位點。

圖4 外顯子8 突變位點測序圖

圖5 內含子12∶rs 199563183 突變位點測序圖

圖6 外顯子13∶rs3733545 突變位點測序圖

2 討論

PAM 是一種罕見的以磷酸鈣鹽顆粒在雙肺肺泡內沉積為特征的疾病，由SLC34A2 基因變異引起。于1868年最早由Marcello 報道描述，之后全世界各大洲均有陸續報道，目前報道的病例數不到1100 例[5-6]，其中以土耳其和歐洲多見。PAM 患者早期癥狀不明顯，多在30～40 歲逐漸出現干咳、呼吸困難、咯血、氣胸及肺心病等癥狀。臨床上主要結合X 線、胸部CT及肺活檢對PAM 進行確診，患者雙肺可見彌漫性砂粒樣鈣化結節影，且隨病情進展鈣化灶逐漸增多并出現聚集融合，呈現“暴風雪”改變。近年來很多研究證實PAM 具有家族遺傳傾向是一種常染色體隱性遺傳病，其家族史報道頻率為32%～61%[2，7]。遺傳病例報道中不存在性別傾向，但散發病例以男性為主（57.7%）[7-8]。

PAM 發病與SLC34A2 基因突變有關，該基因屬于溶質轉運蛋白家族SLC34 的成員之一，位于染色體4p15.31-p15.2，全長21033bp，包括13 個外顯子[9-10]，除第1 個外顯子是非編碼，其余12 個均為編碼外顯子。SLC34A2 在Ⅱ型肺泡上皮細胞高表達，其編碼的轉運蛋白NaPi-Ⅱb 含有690 個氨基酸的多次跨膜蛋白，至少有8 個跨膜α 螺旋區組成，研究推測胞質內側和外側各有一短環具有轉運通路的重要功能區域[11]，其主要作用是從肺泡液中吸收無機磷用于肺泡表面活性物質的合成。當SLC34A2 基因突變后會導致該轉運蛋白形成異常，從而使肺泡內鈣磷轉運失調，磷酸鹽堆積無法清除，從而為微結石的形成提供條件。Saito 等[12]通過小鼠模型研究發現Ⅱ型肺泡上皮細胞缺少NaPi-Ⅱb 可導致肺泡內微結石形成及進行性限制性肺疾病的發生。

目前有許多關于SLC34A2 基因突變的文獻報道，其突變位點有外顯子1、2、3、4、6、7、8、11、12 和13，且分布具有種族或地域傾向[13]。如土耳其病例報道中除外顯子7 和8 未發現突變，其他的外顯子均有突變，日本病例中主要是外顯子7 或8 突變，而在中國的病例報道中多在外顯子8 出現突變，僅有1例突變在外顯子6[14-15]。本病例也呈外顯子8 突變，但與以往報道不同的是該患者SNP 出現新的兩個突變位點即內含子12、外顯子13。其中外顯子8 的突變位點c.910A＞T 來源于父系，即cDNA 的第910 號密碼子由A→T,從而使氨基酸AAA（賴氨酸）→TAA，提前出現終止密碼子，以致不能產生正常功能蛋白從而導致肺泡微結石的形成。基因檢測發現新突變的位點內含子12 及外顯子13 的3′-UTR 區來源于母系，該位點的突變類型尚未報道過。進一步分析發現rs3733545 位于13 號外顯子3′-UTR 區,等位基因二元狀態為G/T，G 為祖先型等位基因，本例患者的等位基因G 來自母親，T 來自父親。由于該SNP 位點的兩種等位基因頻率相近，因此推測其致病的可能性較小。而rs199563183位于12 號內含子第26 位堿基,等位基因二元狀態為G/A，G 為祖先型等位基因，等位基因A 存在極低的群體頻率，有潛在致病的可能，患者該位點的等位基因A 來自母親，與c.910A＞T 來源于不同的單體型，存在致病的可能性。通過家系基因分析看出，父親有外顯子8 的突變，母親有內含子12 的突變，但父親與母親均未發病，而患者完全符合PAM 的特點，由此可見p.K304X 和p.Y455H 的突變可能共同引起了蛋白功能的改變，導致患者自幼發病，病情呈進行性發展的特點。

3 結論

PAM 是一種罕見的肺部疾病，以磷酸鈣鹽顆粒在雙肺肺泡內沉積為特征，有家族遺傳傾向，多呈常染色體隱性遺傳方式發病。其中SLC34A2 在PAM 的發病過程中發揮著重要的作用，對SLC34A2 基因的研究可能成為PAM 精準基因診治的突破點，其是否存在復合雜合突變致病的可能有待進一步探索。中國PAM 患者突變位點更傾向于外顯子8，而外顯子8 的c.910A＞T 突變可能用于中國可疑PAM 患者的臨床基因篩查或治療靶點。