35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑氣相色譜分析方法研究

王 進, 劉雪芬，潘光飛，廖文斌，林怡汝，張俊杰

(浙江禾本科技股份有限公司，浙江 溫州 325008)

精甲霜靈(metalaxyl-M)是甲霜靈的R手性異構體，其活性要比S異構體高20倍以上。精甲霜靈的作用機理與甲霜靈相似，都是通過滲透細胞膜抑制病原菌核糖體RNA聚合酶I的活性來抑制病核酸的生物合成[1-2]。精甲霜靈是一種廣譜殺菌劑，內吸性強。當藥劑噴施到作物上后，能被作物各個器官吸收并傳導，可起到保護和治療的作用。精甲霜靈對霜霉病菌、疫霉病菌和腐霉病菌引起的作物病害的治理效果突出[3]。單一藥劑的使用容易誘發病菌的抗藥性[4]，因此復配試劑經常作為藥劑研發的重點。霜霉威鹽酸鹽(propamocarb hydrochloride)也是一種廣譜殺菌劑，可由霜霉威原藥經鹽酸酸化制備得到，能夠抑制病菌細胞膜成分的卵磷脂和脂肪酸的生化合成，以及抑制菌絲生長、孢子囊的形成和孢子萌發，兼有保護和治療作用。霜霉威鹽酸鹽可有效防治霜霉病、疫病、猝倒病等，多使用于黃瓜、番茄、甜椒、馬鈴薯、煙草等[5]。精甲霜·霜霉鹽是一種新型復配制劑，有田間試驗對比研究表明，其對辣椒疫病有顯著的防治效果[6]。已有的關于精甲霜靈復配制劑的定量大多是采用液相色譜法[7-9]。霜霉威鹽酸鹽不易氣化，可溶于水并以離子形式存在，多采用液相色譜法檢測，但是峰型不好，目前對其的氣相色譜定量分析的報道也較少[5,10]。

本研究建立了35%精甲霜·霜霉鹽可溶劑有效含量測定的方法，利用甲霜靈和霜霉威作為標準品，通過一定的前處理方法和計算方式，采用氣相色譜對試樣中精甲霜靈和霜霉威鹽酸鹽進行定量分析。該方法具有操作簡單、準確度高、線性關系良好等特點，適用于產品質量的檢測控制。

1 實驗部分

1.1 精甲霜靈(R)-異構體比值K值的測定

1.1.1 試劑和溶液

正己烷，色譜純(樂清億邦儀器設備有限公司)；異丙醇，色譜純(樂清億邦儀器設備有限公司)；甲霜靈標樣，純度98.7%(上海農藥研究所有限公司)；35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑，浙江禾本科技股份有限公司提供。

1.1.2 儀器

分析天平，賽多利斯CPA225D(德國Sartorius)，精度為0.00001 g；高效液相色譜儀，Waters Acquity H-Class/PDA檢測器(美國沃特世(waters))；超聲波清洗器(PMI-300TD，PRIMA technology Group)；有機微孔濾膜，孔徑0.45 μm(MILEDT Technology Co.Ltd)。

1.1.3 色譜工作條件

色譜柱，CHIRALCEL OD-H 4.6 mm×150 mm×5 μm(美國Agilent公司)；流動相，正己烷+異丙醇=85+15(體積)；流量，1.0 mL/min；柱溫，35 ℃；測定波長，210 nm；進樣量，5 μL；采樣時間，30 min；

保留時間：(S)-異構體約6 min，(R)-異構體約22.5 min。

典型的甲霜靈標準品及35%精甲霜·霜霉鹽試樣的手性高效液相色譜圖見圖1和圖2。

圖1 甲霜靈標樣正相高效液相色譜圖

圖2 甲霜靈標樣正相高效液相色譜圖

1.1.4 測定步驟

1)甲霜靈標樣溶液配制。稱取含有效成分約0.03 g(精確至0.01 mg)的甲霜靈標樣于50 mL容量瓶中，用25 mL異丙醇超聲溶解，并用正己烷定容，搖勻。

2)試樣溶液配制。稱取約0.3g(精確至0.01 mg)的35%精甲霜靈·霜霉威可溶液劑試樣于50 mL容量瓶中，用25 mL異丙醇超聲溶解，并用正己烷定容，搖勻，于測定前過濾。

3)測定。在1.1.3色譜操作條件下，待儀器基線穩定后，注入數針標樣溶液，直至相鄰兩針甲霜靈(S)-異構體和(R)-異構體的峰面積相對變化小于1.2%后，按照標樣溶液、試樣溶液的順序進樣分析。

4)計算。將測得兩針試樣溶液中精甲霜靈(S)-異構體和(R)-異構體的峰面積分別進行平均。試樣中精甲霜靈(R)-異構體的比值K按公式(1)進行計算：

(1)

式中：AS為試樣溶液中精甲霜靈(S)-異構體的峰面積平均值；AR為試樣溶液中精甲霜靈(R)-異構體的峰面積平均值。

1.2 精甲霜靈、霜霉威鹽酸鹽質量分數的測定

1.2.1 試劑和溶液

丙酮，分析純(浙江中星化工試劑有限公司)；氨水，w(NH3)≥25%(西隴科學股份有限公司)；內標物,鄰苯二甲酸二乙酯，無干擾分析的雜質(國藥集團化學試劑有限公司)；甲霜靈標樣,純度98.7%(上海農藥研究所有限公司)；霜霉威標樣,純度99.4%(上海農藥研究所有限公司)；內標溶液配制：準確稱取鄰苯二甲酸二乙酯1.5g于100mL容量瓶中，用丙酮溶解稀釋至刻度，搖勻備用。

1.2.2 儀器

氣相色譜儀，Agilent GC 8890/具FID檢測器(美國Agilent公司); 分析天平，賽多利斯CPA225D(德國Sartorius)，精度為0.00001 g；超聲波清洗器(PMI-300TD，PRIMA technology Group)；有機微孔濾膜，孔徑0.45 μm(MILEDT Technology Co.Ltd)。

1.2.3 氣相色譜操作條件

色譜柱，HP-5 30 m×0.32 mm×0.25 μm毛細管色譜柱(美國Agilent公司)；載氣，N2；檢測溫度，250℃；控制方式，線速率；柱流量，1.5 mL/min；進樣方式，分流進樣；吹掃流量，3 mL/min；分流比，50∶1；空氣流量，300 mL/min；進樣量，1.0 μL；氫氣，30 mL/min;氣化溫度，250℃；尾吹流量，30 mL/min；柱溫：150℃保持5 min，以20 ℃/min升溫至250℃，保持20 min。保留時間：霜霉威約4 min， 鄰苯二甲酸二乙酯約7 min，甲霜靈約10 min(見圖3和圖4)。

1.2.4 測定步驟

1) 標樣溶液的配制。準確稱取甲霜靈標樣0.05 g(準確至0.01 mg)、霜霉威標樣0.1g(準確至0.01 mg)標樣于10 mL容量瓶中，用移液管移入5.00 mL內標溶液，超聲溶解，搖勻。

2) 試樣溶液的配制。準確稱取含甲霜靈0.05 g(準確至0.01 mg)的試樣于10 mL容量瓶中，用移液管移入5.00 mL內標溶液超聲溶解，再加入4滴濃氨水將霜霉威鹽酸鹽轉化為霜霉威，充分搖勻，于測定前過濾。

3)測定。在2.2.3色譜操作條件下，待儀器基線穩定后，注入數針標樣溶液，直至兩針有效成分和內標物峰面積比相對變化小于1.2%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進樣分析。

1.霜霉威標樣；2.鄰苯二甲酸二己酯；3.甲霜靈標樣。

圖3 甲霜靈·霜霉威的標準品氣相色譜圖

1.霜霉威；2.鄰苯二甲酸二己酯；3.甲霜靈。

4)計算。將測得的兩針試樣溶液，以及試樣前后兩針標樣溶液中的甲霜靈(霜霉威)峰面積與內標物峰面積的比值分別進行平均。其中，精甲霜靈質量分數x1按公式(2)計算，霜霉威鹽酸鹽的質量分數x2按公式(3)計算。

(2)

(3)

式中：P1為甲霜靈標準品的純度，以%表示；r1為標樣溶液中甲霜靈和內標物峰面積比的平均值；r2為試樣溶液中甲霜靈與內標物峰面積比的平均值；m1為標樣溶液中甲霜靈標準品的稱樣質量(g)；m2為試樣質量(g)；K為試樣中精甲霜靈(R)-異構體的比值。P2為霜霉威標準品的純度，以%表示；r3為標樣溶液中霜霉威和內標物峰面積比的平均值；r4為試樣溶液中霜霉威與內標物峰面積比的平均值；m3為標樣溶液中霜霉威標準品的稱樣質量(g)；m2為試樣質量(g)；224.7為霜霉威鹽酸鹽的相對分子質量；188.3為霜霉威的相對分子質量。

2 結果與分析

2.1 內標物的選擇

經過優化后的甲霜靈、霜霉威與鄰苯二甲酸二乙酯在試驗條件下，出峰時間相近，分離度好，且相互之間無干擾，符合內標物的標準，可以滿足對精甲霜·霜霉鹽可溶液劑進行定量分析的要求。

2.2 分析方法的線性相關性的測定

分別稱取不同質量的甲霜靈和霜霉威標樣于10 mL容量瓶中，用5.00 mL內標溶液超聲溶解，搖勻，配制成不同質量濃度的甲霜靈(或霜霉威)系列標樣溶液。以甲霜靈(或霜霉威)質量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到甲霜靈和霜霉威的線性相關曲線。甲霜靈的線性方程為y=0.0139x-0.0154，相關系數r=1.0>0.99。霜霉威的線性方程為y=0.0119x-0.0416，相關系數r=0.9999>0.99，因此均在線性范圍內(見圖5和圖6)。

圖5 甲霜靈的線性關系圖

圖6 霜霉威的線性關系圖

2.3 分析方法的精密度試驗

按照1.2.3色譜條件，對同一試樣平行測定6次。甲霜靈測定結果的標準偏差為0.04%，相對標準偏差RSD為0.37%，重復性測定結果小于0.67×2(1-0.5×lgC)(修訂后的Horwits公式)1.88%；霜霉威測定結果的的標準偏差為0.09%，相對標準偏差RSD為0.40%，重復性測定結果小于0.67×2(1-0.5×lgC)(修訂后的Horwits公式)1.69%。結果表明(表1)，同一批次產品的檢測結果重復性良好，檢測結果可以接受，能夠滿足日常檢測工作的需要。

2.4 分析方法的準確度測定試驗

根據1.2.4溶液制備方法，分別稱取試樣溶液一半的試樣稱樣量和標樣溶液一半的稱樣量，用移液管移取5 mL內標溶液，再加入4滴濃氨水，超聲溶解過濾。按照上述(1.2.3)分析方法分別測定其中的甲霜靈和霜霉威的總的質量，并計算其回收率，甲霜靈和霜霉威的平均回收率分別為100.26%和99.53%，符合回收率標準范圍98%～102%。結果見表2。

表1 分析方法的精密度試驗結果

表2 分析方法準確度測定試驗結果

3 結論

本試驗建立了35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑中有效成分的氣相色譜分析方法。結果表明：35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑在測試質量濃度范圍內線性關系良好，方法準確度和精密度高。該方法采用常用的甲霜靈和霜霉威為標準品，并且在同一試驗條件下能夠分離試樣中有效成分，具有操作簡便、快速的特點，是產品質量控制較為理想的分析方法。