《天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》中鹽酸小檗堿不同提取方法的比較*

閆玉鑫，楊 穎，王吉華，劉靖平

(云南師范大學(xué) 職業(yè)技術(shù)教育學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，云南 昆明 650092)

《天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》是藥學(xué)專業(yè)本科生的一門重要實(shí)驗(yàn)課。通過該實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)，可以讓學(xué)生對(duì)理論知識(shí)，如中藥材成分的結(jié)構(gòu)、提取分離方法、結(jié)構(gòu)檢識(shí)方法等，建立更加直觀的概念，對(duì)于提高學(xué)生的科學(xué)研究能力和創(chuàng)新思維具有重要作用。經(jīng)過幾年的實(shí)踐，筆者發(fā)現(xiàn)，多數(shù)院校的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容比較固定，主要涉及天然藥物化學(xué)成分的主要結(jié)構(gòu)類型，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是按照一般的研究流程即“提取、分離、檢識(shí)”來安排，學(xué)生按照講義上的內(nèi)容即可完成實(shí)驗(yàn)。為了改變這一現(xiàn)狀，學(xué)院逐漸對(duì)開設(shè)的一些實(shí)驗(yàn)課程進(jìn)行改革，通過改變實(shí)踐教學(xué)模式，創(chuàng)建新的實(shí)踐課程體系，并加大對(duì)學(xué)生動(dòng)手能力和創(chuàng)造能力的訓(xùn)練。本文以天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中小檗堿的提取為例，讓學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

黃連(Coptis chinensis Franch.)屬毛茛科黃連屬多年生草本植物，野生或栽培于海拔1000～1900 m 的山谷涼濕蔭蔽密林中。在云南分布有云南黃連，多為野生。研究發(fā)現(xiàn)，黃連中含多種異喹啉類生物堿。其中，小檗堿可達(dá)藥材干質(zhì)量的10%左右，主要以鹽酸鹽的狀態(tài)存在，在臨床上主要對(duì)痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、金葡菌、鏈球菌、傷寒桿菌及阿米巴原蟲有抑制作用[1]。小檗堿在黃連中的含量高，分離鑒定現(xiàn)象明顯，產(chǎn)品比較容易獲得。作為生物堿性化合物的代表，在《天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)中通常安排小檗堿的提取實(shí)驗(yàn)。本文在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以黃連中提取小檗堿為例，讓同學(xué)們自己查閱文獻(xiàn)，自主設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，主要通過設(shè)計(jì)不同的提取方法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)中粗制、精制小檗堿的產(chǎn)率進(jìn)行分析，用紫外分光光度法測(cè)定精制小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，探索天然藥物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革。

1 分組

通過查閱文獻(xiàn)[2-6]，教學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的提取方法主要有：酸水常溫浸提法、酸水煎煮法、乙醇回流提取法、超聲輔助萃取法。為了保證實(shí)驗(yàn)的平行性，我們選用3種提取方法，擬定提取時(shí)間為 1 h，將90名學(xué)生分為3組，第1組用酸水煎煮法，第2組用乙醇回流提取法，第3組用連續(xù)回流提取法。

2 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：紫外光譜儀、索氏提取器，加熱套、燒杯、容量瓶、移液管、濾紙。

實(shí)驗(yàn)試劑：黃連根粉，0.3%硫酸(體積分?jǐn)?shù))，95%乙醇，石灰乳，10%氫氧化鈉溶液，10%鹽酸，5%醋酸，濃鹽酸。

3 鹽酸小檗堿的提取及精制

3.1 硫酸浸提法

黃連粗粉 20 g，加0.3%H2SO4150 mL，不斷補(bǔ)充0.3%H2SO4使溶液體積維持 150 mL。煎煮 1 h，過濾，濾液加新鮮石灰乳調(diào)至pH值約為7，放置 20 min，抽濾。濾液加HCl調(diào)pH為 2～3，加濾液等體積10%的NaCl溶液，放置、冷卻、析晶，得到粗制小檗堿，稱量質(zhì)量。稱取 1 g 小檗堿粗品，加 30 mL 的乙醇加熱至澄清趁熱抽濾，濾液放置，再抽濾，得精制小檗堿，稱量并計(jì)算產(chǎn)率。

3.2 加熱回流法

稱取黃連粗粉 20 g 放入 250 mL 圓底燒瓶，加入 150 mL 95%乙醇，加熱回流 1 h，放置 1 h，抽濾，濾液放入蒸發(fā)皿中，水浴加熱蒸發(fā)多余的乙醇，將濾液濃縮至棕紅色糖漿狀，加入 35 mL 5%醋酸溶解，然后過濾，向?yàn)V液中加濃鹽酸至出現(xiàn)渾濁(pH約為1)，放置至冷卻，析晶，得到粗制小檗堿，稱量質(zhì)量。稱取 1 g 小檗堿粗品，加 30 mL 的乙醇加熱至澄清趁熱抽濾，濾液放置，再抽濾，得精制小檗堿，稱量并計(jì)算產(chǎn)率。

3.3 索氏提取法

裝好索氏提取裝置。稱取 20 g 黃連粗粉，放入索氏提取器的濾紙?zhí)淄仓校?250 mL 圓底燒瓶中加入 150 mL 95%的乙醇和幾塊沸石，用加熱套加熱，連續(xù)提取 1 h 。萃取液顏色變淡時(shí)，停止萃取。待冷凝液剛剛虹吸下去時(shí)，立即停止加熱。放置 1 h，抽濾，濾液放入蒸發(fā)皿中，水浴加熱蒸發(fā)多余的乙醇，將濾液濃縮至棕紅色糖漿狀，加入 35 mL 5%醋酸使溶解，然后過濾，濾液中加濃鹽酸至出現(xiàn)渾濁(pH約為1)，放置至冷卻，析晶，得到粗制小檗堿，稱量質(zhì)量。稱取 1 g 小檗堿粗品，加 30 mL 的乙醇加熱至澄明趁熱抽濾，濾液放置，再抽濾，得精制小檗堿，稱量并計(jì)算產(chǎn)率。

4 鹽酸小檗堿的定量檢測(cè)

4.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

鹽酸小檗堿對(duì)照品液的制備。精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品 1 mg，置于 100 mL 容量瓶中，加乙醇溶解至刻度，搖勻，用乙醇為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在 200～400 nm 范圍內(nèi)測(cè)定最大吸收峰，結(jié)果在 350 nm 處有最大吸收峰且為單峰。因此，測(cè)定波長(zhǎng)為 350 nm。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取鹽酸小檗對(duì)照品 20 mg，置 100 mL 容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度。精密量取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，5.0，10.0 mL，分別置 100 mL 容量瓶中，加乙醇定容，搖勻，以乙醇為空白對(duì)照，在 350 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度(ρ)對(duì)吸收度(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.0853698ρ+0.00349631，r=0.99953。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在0～20 μg/mL 范圍內(nèi)與吸收度呈良好線性關(guān)系。

4.3 樣品含量測(cè)定

精密稱取3種實(shí)驗(yàn)方法下的精制鹽酸小檗堿各 10 mg，置 100 mL 容量瓶中，加乙醇定容，分別精密量取 6 mL，置 100 mL 容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。在 350 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，按回歸方程計(jì)算每種提取方法下小檗堿的濃度，結(jié)果見表1，進(jìn)一步求算出精制小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 三種提取方法所得小檗堿的質(zhì)量及紫外光譜法測(cè)得吸光度值、精制小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

5 結(jié)果與討論

1)每個(gè)小組去掉5名產(chǎn)量差異大的同學(xué)，其他25名同學(xué)鹽酸小檗堿平均提取率見表1。實(shí)驗(yàn)表明，索氏提取法提取粗品的質(zhì)量最高，提取效率較高，硫酸煎煮法提取的小檗堿的質(zhì)量最低。

2)對(duì)每種方法得到的精制鹽酸小檗堿進(jìn)行紫外分光光度法定量，硫酸煎煮法提取小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，索氏提取產(chǎn)品中小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。用稀硫酸提取生物堿性化合物時(shí)提取雜質(zhì)類化合物的量少，而索氏提取法提取其他雜質(zhì)的量較多。

3)回流提取法中精制小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于索氏提取法，原因在于回流提取法中用熱乙醇提取，索氏提取法用冷乙醇提取，小檗堿在熱乙醇的溶解度較高，回流提取法的效率較索氏提取高。硫酸提取法提取的小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于回流提取法，考慮到硫酸提取法中用到大量的硫酸液，回收困難，對(duì)環(huán)境有一定的污染，因此回流提取法可作為學(xué)生實(shí)驗(yàn)提取小檗堿的最好方法。

4)在教師的指導(dǎo)下學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，不但提高學(xué)生查閱文獻(xiàn)、對(duì)理論知識(shí)思考的能力，而且通過實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題，實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)量、產(chǎn)率，學(xué)生會(huì)積極的加以分析，極大的調(diào)動(dòng)了學(xué)生的積極性，達(dá)到較理想的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。