表面活性素體外抗菌效果研究

趙 賓，白 靜

（1.北京英惠爾生物技術(shù)有限公司，北京 100081；2.北京師范大學(xué)靜海附屬學(xué)校，天津 301636）

表面活性素（Surfactin）是芽孢桿菌通過(guò)非核糖體合成途徑合成的小分子脂蛋白。它由4 個(gè)亮氨酸、1個(gè)纈氨酸、1個(gè)谷氨酸和1個(gè)天冬氨酸共7個(gè)氨基酸殘基的多肽環(huán)通過(guò)酯鍵與含有12~17個(gè)碳原子β-羥基脂肪酸結(jié)合形成內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩性化合物[1]。它是一種極具應(yīng)用前景的微生物表面活性劑，只需較少劑量就可以使溶液體系界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化[2]。正是由于其極強(qiáng)的表面活性能力賦予了它抗菌殺菌活性，其抗菌作用方式與抗生素不同，不具有特異性，不易引起病原菌的耐藥性突變，隨著細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，人們渴望找到新型的抗菌殺菌產(chǎn)品，表面活性素就是抗生素的理想替代品之一[3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)“禁抗令”的頒布，表面活性素越來(lái)越被行業(yè)所關(guān)注。

許多研究表明，表面活性素具有抗細(xì)菌、真菌、腫瘤和病毒的作用，抗菌譜較廣[4]，但是其對(duì)動(dòng)物源致病菌的抑制效果報(bào)道少見(jiàn)。據(jù)此，筆者研究了表面活性素體外抗動(dòng)物源性致病菌產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與沙門(mén)氏菌的作用效果，并且與部分抗生素在抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的能力方面進(jìn)行了對(duì)比，旨在為表面活性素作為飼料添加劑在養(yǎng)殖行業(yè)中替代傳統(tǒng)抗生素應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 主要試劑及儀器

表面活性素（Surfactin），購(gòu)自海麥克林生化科技有限公司；桿菌肽和亞甲基水楊酸桿菌肽，購(gòu)自綠康生化股份有限公司；LB與RCM 培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；紫外分光光度計(jì)（型號(hào)為UV5），購(gòu)自梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為HT-600B），購(gòu)自冠森生物科技（上海）有限公司。

1.2 菌株

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124、產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52、產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027、金黃色葡萄球菌ATCC6538P、大腸桿菌CVCC233、沙門(mén)氏菌SK236，均來(lái)自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

2 方 法

2.1 指示菌的活化及培養(yǎng)

從甘油管中吸取產(chǎn)氣莢膜梭菌200 μL，分別轉(zhuǎn)接至含有5 mL 的無(wú)菌RCM 液體培養(yǎng)基的試管中，各吸取1 mL 無(wú)菌液體石蠟加入接種完畢的試管中，置于培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液以2%的接種量接入新的裝有50 mL 無(wú)菌RCM 液體培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，各吸取5 mL 無(wú)菌液體石蠟加入接種完畢的試管中，置于培養(yǎng)箱，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h。調(diào)整菌濃度為5×108cfu·mL-1，獲得試驗(yàn)用指示菌懸液，置4 ℃冰箱中貯存，備用。

分別從甘油管中吸取大腸桿菌CVCC233、金黃色葡萄球菌ATCC6538P 和沙門(mén)氏菌SK236 各200 μL，轉(zhuǎn)接至含有5 mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基的試管中，置于搖床培養(yǎng)中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)后的菌液以2%的接種量接入新的裝有50 mL 無(wú)菌LB 液體培養(yǎng)基的搖瓶中，置于恒溫?fù)u床中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)18 h。調(diào)整菌濃度為1.5×108cfu·mL-1，獲得試驗(yàn)用指示菌懸液，置4 ℃冰箱中貯存，備用。

2.2 指示菌培養(yǎng)平板的制備

分別將指示菌懸液以2%的比例接種至無(wú)菌的固體培養(yǎng)基中（50 ℃），混勻后趁熱倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中冷卻，制得指示菌培養(yǎng)平板。

2.3 表面活性素對(duì)不同致病菌的抑菌效果

在無(wú)菌條件下將牛津杯置于制備好的指示菌平皿內(nèi)，于牛津杯內(nèi)加入10 μg·mL-1表面活性素100 μL（每樣品做3 個(gè)平皿），將其放入4 ℃冰箱過(guò)夜[5]。待藥液充分?jǐn)U散后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，其中產(chǎn)氣莢膜梭菌指示菌平皿厭氧培養(yǎng)，其他致病菌有氧培養(yǎng)。取出后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最終求3次試驗(yàn)的平均值。

2.4 表面活性素與抗生素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

取無(wú)菌試管11支，排成一排，第1支加入4.6 mL的RCM培養(yǎng)基，其余各管均加入1 mL的RCM，在第1 管中加入1 000 μg·mL-1測(cè)試樣品0.4 mL，混勻，然后再吸取1 mL 于第2 管中，混勻再吸取1 mL 至第3 管中，如此倍比稀釋至第9 管，從第9 管中吸取1 mL 棄去，第10 管為不含測(cè)試樣品的對(duì)照管，第11管為只加RCM的陰性對(duì)照[6-7]。觀察結(jié)果并記錄，與對(duì)照組對(duì)比后確定MIC。

3 結(jié)果與分析

3.1 表面活性素對(duì)不同致病菌的抑菌效果

測(cè)定表面活性素對(duì)不同致病菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 7種致病菌的抑菌圈直徑平均值（R） mm

由表1可以看出，表面活性素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124、產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 病原性的產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌圈直徑均超過(guò)了15 mm，說(shuō)明表面活性素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌為極敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為8.78 mm，對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌沒(méi)有產(chǎn)生抑菌圈，說(shuō)明表面活性素對(duì)大腸桿菌CVCC233和沙門(mén)氏菌SK236 的抑制作用不明顯或者沒(méi)有抑制作用。

3.2 最小抑菌濃度的測(cè)定

測(cè)定表面活性素、桿菌肽、亞甲基水楊酸桿菌肽對(duì)4種產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 表面活性素與2種抗生素對(duì)4種產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC μg·mL-1

由表2可知，表面活性素、桿菌肽和亞甲基水楊酸桿菌肽對(duì)4 種產(chǎn)氣莢膜梭菌均具有良好的抑菌效果，但MIC 尚有差別。表面活性素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124的MIC為10 μg·mL-1，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 的MIC為20 μg·mL-1，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030 的MIC為40 μg·mL-1；桿菌肽對(duì)4 種產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC均為16 μg·mL-1；亞甲基水楊酸桿菌肽對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124 的MIC 為0.5 μg·mL-1，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC52 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 的MIC為1 μg·mL-1，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030 的MIC為2 μg·mL-1。由以上結(jié)果可知，表面活性素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果與桿菌肽對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果大體一致。

4 討 論

本研究表明，表面活性素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌均產(chǎn)生了明顯的抑菌圈，這與前人研究結(jié)果一致[8-9]。但表面活性素對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等革蘭氏陰性菌沒(méi)有產(chǎn)生抑菌圈，表明表面活性素對(duì)這兩種陰性致病菌抑制作用不明顯或者沒(méi)有抑制作用。Zhou Z.Y.等[10]研究結(jié)果顯示表面活性劑能抑制大腸桿菌，但對(duì)沙門(mén)氏菌沒(méi)有有效的抑制作用。Huang X.Q.等[11]的研究結(jié)果顯示表面活性素對(duì)沙門(mén)氏菌有較高的殺菌效果。這可能是因?yàn)楸砻婊钚运刂粚?duì)部分大腸桿菌和沙門(mén)氏菌有抑制作用，所以導(dǎo)致了本次試驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)存在差異，此結(jié)果為后續(xù)探究表面活性素的抑菌譜提供了參考。

產(chǎn)氣莢膜梭菌引起豬、牛、羊發(fā)病死亡率逐年升高，而且患畜死亡突然，易被懷疑為中毒死亡，在養(yǎng)殖業(yè)日益發(fā)達(dá)的今天，產(chǎn)氣莢膜梭菌是所有梭菌屬中引起腸道疾病最嚴(yán)重的病原[12-13]。桿菌肽作為多肽類(lèi)抗菌藥物，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，被廣泛應(yīng)用在飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域[14-15]。本研究表明桿菌肽類(lèi)抗生素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，表面活性素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果與桿菌肽對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果相近。表面活性素作為脂肽類(lèi)生物表面活性劑具有廣譜抗菌作用，表面活性素通過(guò)破壞細(xì)胞膜來(lái)發(fā)揮其抗菌作用[16]。表面活性素在合適濃度下，能夠在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成離子傳導(dǎo)孔[17-18]，與Ca2+發(fā)生結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞膜的滲透作用，破壞細(xì)胞膜發(fā)揮其抗菌作用。表面活性素還可以驅(qū)動(dòng)其他單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子通過(guò)有機(jī)屏障，從而抑制環(huán)磷酸二酯酶的活性[19-20]，所以表面活性素對(duì)細(xì)菌的抑制作用沒(méi)有特異性，不易引起病原菌的耐藥性突變。由于表面活性素產(chǎn)量低，提純成本高，用表面活性素直接飼喂動(dòng)物的應(yīng)用研究不多。多數(shù)研究還是利用芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵和固體發(fā)酵產(chǎn)生的多種脂肽代謝物去飼喂動(dòng)物，并研究代謝物中表面活性素含量和飼喂效果的關(guān)系。比如，地衣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物改善了受球蟲(chóng)攻毒后肉雞的日增重，增加了抗球蟲(chóng)活力，調(diào)節(jié)了有益菌和有害菌的組成[21]。枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物顯著改善了梭菌攻毒狀態(tài)下肉雞的腸道形態(tài)和腸炎壞死情況，發(fā)酵物中的表面活性素是抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的有效抗菌肽[22]。地衣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物顯著改善了梭菌攻毒狀態(tài)下肉雞的腸道形態(tài)和腸炎壞死情況，效果比商業(yè)抗生素還要好[21-23]。隨著“禁抗令”的實(shí)施，表面活性素作為抗生素的替代品在畜禽生產(chǎn)和飼料加工中具有廣泛的應(yīng)用前景[16]。

表面活性素不僅具有廣譜抗菌的優(yōu)點(diǎn)，而且在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料利用率、提高胴體品質(zhì)等方面有積極作用[16]。斜帶石斑魚(yú)飼料中添加100 mg 的表面活性素能夠調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝酶的活性，降低血清中總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇的濃度，增加高密度脂蛋白膽固醇的濃度，改善脂質(zhì)代謝，從而改善機(jī)體健康狀況[24]。同時(shí)，表面活性素能夠促進(jìn)生長(zhǎng)，提高飼料系數(shù)，提高斜帶石斑魚(yú)消化道蛋白酶和脂肪酶活性，降低血清中尿素氮、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性，提高白蛋白和溶菌酶水平[25]。陳旭波[26]研究表明，斷奶仔豬日糧中添加100~150 mg·kg-1的表面活性素可明顯改善腹瀉率，具有促生長(zhǎng)作用，同時(shí)能降低血清中尿素的含量，具有一定降血脂作用。

5 結(jié) 論

表面活性素具有廣譜抗菌作用，尤其對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的有著較強(qiáng)的抑制能力，在飼料添加劑領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。