含烏梅方劑數據挖掘及烏梅-人參治療糖尿病的網絡藥理學分析*

魏稚力，張小波，高蕊，簡勝男，馬曉菊，文躍強，周昕，沈濤

成都中醫藥大學基礎醫學院 四川成都 610072

糖尿病（Diabetes Mellitus， DM）作為全球性公共衛生問題，嚴重危害人類健康。據2017年相關報道，目前全球共有4.25億成人DM患者，而我國這一數字高達1.14億，居世界首位[1]。現降糖藥種類繁多，因其各自臨床特點與不良反應，尋求更加安全有效的治療藥物一直是該疾病的研究熱點[2]。DM屬中醫“消渴”范疇，但二者并不能等同[3]。相較于現代DM以血糖升高為主要診斷依據，消渴則以多飲、多食、多尿、消瘦等“三多一少”癥狀為典型表現[4]。消渴雖不等同于現代DM，但對于DM的治療亦可從“消渴”相關中醫治療獲益。大量研究顯示，中醫藥治療可發揮降低患病風險、降低血糖，改善胰島素抵抗、提高胰島素敏感性、改善DM癥狀及其并發癥損傷等多種治療作用[4-8]。鑒于此，基于中醫藥資源挖掘治療DM的有效藥物組合具有積極研究意義。

有關烏梅功效應用，《本經》[9]云：“下氣，除熱煩滿，安心，肢體痛，偏枯不仁，死肌，去青黑志、惡疾。”《景岳全書》載其：“止消渴……消癰疽瘡毒”[10]。2015年版《中國藥典》[11]載其用于：“虛熱消渴”。現代化學藥理研究報道，烏梅中有機酸成分——蘋果酸、枸櫞酸可降低正常小鼠血糖水平，烏梅果肉中三萜類成分——熊果酸、齊墩果酸具有降血糖作用[12，13]。臨床研究報道，烏梅丸可降低2型DM患者血糖水平[14]。除臨床藥用外，烏梅作為一種藥食同源性資源，亦被廣泛運用于大眾生活當中，如用于各類烏梅飲品及凉果蜜餞的制作等。鑒于烏梅藥用價值及開發應用前景，本研究對《中醫方劑大辭典》中含烏梅方劑進行收集整理，并運用TCMISS進行數據挖掘分析。在此基礎上，選取烏梅-人參核心藥對，并運用網絡藥理學方法進一步探討該藥對治療DM的潛在作用機制，以期為烏梅的臨床運用及后續研究提供更多參考。

資料與方法

1 方劑來源

以“烏梅”為檢索關鍵詞（“烏梅肉”“大烏梅”“烏梅炭”等均作為藥物烏梅納入檢索結果）對《中醫方劑大辭典》[15]中含烏梅方劑進行篩取。

2 數據規范

主要涉及中藥因產地、別名、炮制加工、入藥部位等情況進行藥名規范處理，主要參照2015年版《中國藥典》[11]及《中藥別名大辭典》[16]對所篩方劑進行藥名規范。

3 中醫傳承輔助系統分析

3.1 數據錄入 通過TCMISS“平臺管理”模塊的“方劑管理”功能，將方名、方源、組成、主治疾病等信息錄入系統建立數據庫，并由雙人進行數據核對與校正。

3.2 統計與關聯規則分析 運用TCMISS“數據分析”模塊之“方劑分析”、“數據查詢”等功能，輔以Excel數據表格，對查詢出的目標方劑進行相關統計與關聯規則分析。

4 網絡藥理學分析

4.1 有效成分的收集 借助TCMSP檢索烏梅和人參中的化學成分。一般認為藥物動力學（ADME）性質中口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）具有重要意義，滿足OB≥30%和DL≥0.18的化合物通常被認為是潛在的活性成分，故以此為標準進行活性成分的篩選。同時，在TCMSP上下載符合條件成分的分子結構，保存為MOL2格式。4.2 成分潛在靶點預測及疾病靶點獲取 將前一步獲得的成分結構導入Swiss Target Prediction數據庫以獲得各成分的作用靶點，并對獲取的靶點進行合并、去重。在Genecards數據庫中以“Diabetes mellitus”為關鍵詞檢索DM的相關治療靶點，保留相關性得分大于20的靶點。之后將獲得的成分靶點與疾病靶點進行取交集。

4.3 PPI網絡構建 將Swiss Target Prediction數據庫獲得的靶點導入 STRING 網絡平臺，蛋白種類定義為“人”，置信度>0.7設為篩選條件進行篩選，獲得蛋白互作關系，下載TSV格式文件。將TSV文件信息導入Cytoscape3.7.1中，并運用其插件“Network Analyze”分析網絡拓撲參數，以節點度值、介數均超過平均值為標準篩選出核心靶點。

4.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析 利用R軟件的Bioconductor數據包對PPI中所涉及的核心調控基因進行GO富集分析與KEGG通路富集分析，并畫出富集分析的氣泡及柱狀圖。

結 果

1 統計與關聯規則分析

本研究共篩取整理出《中醫方劑大辭典》含烏梅方劑1373首，涉及中藥663味。其中用藥頻次前20位的藥物，見表1，可見除甘草外，烏梅最常與人參聯用。根據《中藥學》[17]藥物分類標準，對常與烏梅聯用的前100位藥物進行分類統計，見表2，提示烏梅常與補虛藥、清熱藥、解表藥、理氣藥、溫里藥、化痰止咳平喘藥等聯用。基于關聯規則Apriori算法，分析48首含烏梅治療消渴方劑的用藥規則，得到支持度≥0.29，置信度為1的含烏梅治療消渴的強關聯規則藥對組合（核心藥對），見表3。篩得含烏梅-人參主治消渴的歷代方劑11首，見表4。

表1 含烏梅方劑前20位常用藥物（頻次≥119）

表2 常與烏梅聯用的前100位藥物的分類情況

表3 含烏梅治療消渴的強關聯規則藥對組合（核心藥對）

表4 含烏梅-人參主治消渴方劑

2 烏梅-人參藥對治療DM的網絡藥理學分析

2.1 烏梅、人參活性成分 基于TCMSP共獲得27個成分，得到烏梅活性成分8個，人參活性成分22個，其中Stigmasterol、beta-sitosterol和kaempferol為二者共有成分，見表5。

表5 烏梅-人參活性成分基本信息

2.2 成分潛在靶點 通過Swiss Target Prediction預測并提出重復目標后，共得到627個烏梅、人參的治療靶點。Genecards數據庫分析得到DM相關靶點301個。將成分靶點與疾病靶點進行取交集后共得到52個共同靶點，見圖1。

圖1 烏梅-人參疾病-成分靶點韋恩圖

2.3 PPI分析 在PPI網絡中，具有較高“度”值的節點通常認為是關鍵靶標蛋白。如圖2所示，AKT1（21）、TNF（20）、VEGFA（20）、MAPK1（18）、STAT3（18）、TP53（18）、MAPK8（16）、PIK3CA（15）具 有 較 高的度值，在網絡調控中起關鍵作用，其很可能是烏梅-人參藥對治療DM的關鍵靶標蛋白。

圖2 關鍵靶標蛋白信息條形圖

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 GO富集分析描述了一系列復雜的事件，這些事件是由一個或多個層次通過組織良好的協同作用來完成的。如圖3所示，展示了前20條GO途徑，主要集中在激素結合、類固醇激素受體活性、胰島素受體底物結合、核受體活性、胰島素樣生長因子受體結合、胰島素受體結合等方面。KEGG前20條途徑主要集中在DM并發癥中的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、胰島素抵抗、內分泌抵抗、VEGF信號通路、II型糖尿病、TNF信號通路、Rap1信號通路等通路上，見圖4。

圖3 前20條GO富集途徑

圖4 前20條KEGG通路富集途徑

討 論

中醫藥防治DM多從“消渴”論之。消渴傳統病機以“陰虛燥熱”為主論，治以滋陰清熱，并分消論治[18]。但氣與津液關系密切，津液之生成、輸布、排泄，有賴于氣的推動、固攝及升降出入運動，而氣亦離不開津液之滋潤與運載[19]。《神農本草經疏》[20]云：“消渴者，津液不足之候也，氣回則津液生，津液生則渴自止矣。”隨著現代醫家對DM臨床實踐與認識的不斷深入，對于DM中醫核心病機的概括亦出現了新的認識。沈紹功教授對538例2型DM患者進行辨證調研，發現氣陰兩虛證高達77.51%，明顯高于傳統陰虛燥熱證，之后進一步提出轉變對2型DM “陰虛燥熱”病機的一般認識，并以“氣陰兩虛側重氣虛”為消渴之病機關鍵[21]。張延群等收集2080例DM患者臨床資料，統計顯示氣虛證頻率達88.75%，居首位，高于陰虛證的64.09%[22]。謝春光教授提出“氣陰兩虛”為現代DM發生發展的核心病機，并以益氣養陰為治療原則，自擬方“參芪復方”獲得良好臨床療效[23]。可見“益氣養陰”對于現代DM防治的重要指導意義。

本研究以含烏梅方劑數據挖掘為切入點，從頻次來看，盡管甘草亦屬補氣藥且頻次高于人參，但其在許多方劑中常作調和藥性之用，且在配伍中常與人參同用或輔助人參發揮補益類作用，如炙甘草湯（《傷寒論》）、四君子湯（《局方》）等[24]。此外，在基于關聯規則分析得到的核心藥對中，除人參、甘草外，麥冬、葛根、天花粉并不屬補氣藥。故本研究優先選取烏梅-人參這一核心藥對，并進一步探討其治療DM的潛在作用機制。

烏梅酸斂，生津除煩；人參甘補，益氣生津。二藥相伍，相輔相成，益氣同時養陰生津之功益彰，具“酸甘化陰”之義。酸甘化陰法用治消渴由來已久，首見于仲景所制之腎氣丸，方中山茱萸與干地黃、山藥伍用，酸甘化陰，亦寓陰中求陽之意。此外，諸如口含酸棗丸（《備急千金要方》）、六味地黃丸（《小兒藥證直訣》）、烏梅四物湯（《醫門八法》）、生脈散（《醫學啟源》）、玉泉丸（《雜病源流犀燭》）等典型酸甘化陰法配伍的方劑亦被廣泛用于消渴的臨床治療[25，26]。研究報道，烏梅作君藥的酸甘化陰法方劑可改善氣陰兩虛型2型DM患者中醫證候，并降低空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數[27]。烏梅-人參藥對切合消渴“氣陰兩虛”病機，亦是中醫酸甘化陰法之典型運用，其對于現代DM的相關研究值得進一步深入。

本研究進一步運用網絡藥理學方法對烏梅-人參藥對進行DM相關作用機制探討。TCMSP搜集得到二藥共有27個成分，可作用于52個DM相關靶點。PPI網 絡 分 析 表 明AKT1、TNF、VEGFA、MAPK1、STAT3、TP53、MAPK8和PIK3CA可能是烏梅-人參治療DM的主要靶點。TNF是一組可以引起細胞死亡的細胞因子，該家族包括兩個成員，TNF-α和TNF-β。其中TNF-α參與了全身炎癥反應，同時它可以通過減弱胰島素的信號轉導途徑，減少脂肪細胞中的葡萄糖轉運，以及抑制脂聯素等方式在胰島素抵抗中發揮重要作用[28]。STAT3是STAT家族中的成員，其除了參與癌細胞的信號傳導，還在調節糖類及脂質代謝， 維持機體內環境穩態等方面扮演著重要角色。研究表明，STAT3可通過抑制肝臟糖異生的關鍵基因Pck1和G6pc來改善胰島素抵抗癥狀[29]。P53蛋白由17號染色體上的P53基因編碼，P53蛋白在維持細胞正常生長、抑制惡性增殖中起著重要作用，并與胰島素抵抗關系密切，是治療DM的新靶點[30]。

KEGG分析顯示，52個與DM相關的靶點主要富集在胰島素及胰島素并發癥相關通路上。胰島素抵抗是引起DM的重要原因。通常，肥胖誘發的慢性炎癥會引起IL-6、TNF-α等炎性因子的增加，而TNF-α會誘導JNK的激活，激活的JNK可以使胰島素信號通路中IRS蛋白上的Ser位點磷酸化，導致其相應Tyr位點的磷酸化降低，從而使下游的PI3K、AKTV蛋白不能被活化，從而產生胰島素抵抗[31]。IL-6可以激活STAT3，誘導SOCS蛋白表達，進而抑制IRS-1酪氨酸磷酸化，使胰島素PI3K信號轉導受阻，最終引起胰島素抵抗[32]。PPI網絡分析表明烏梅-人參藥對可以與關鍵靶點TNF、STAT3和PIK3CA產生作用，因而其可能通過調節胰島素抵抗通路中的TNF-α/JNK/PI3K或IL-6/STAT3/PI3K途徑來治療DM，如圖5所示。

圖5 胰島素抵抗信號通路圖

綜上，本研究通過整理《中醫方劑大辭典》中含烏梅方劑，運用中醫傳承輔助系統對其進行數據挖掘，并以DM “氣陰兩虛”病機為切入點，選取烏梅-人參核心藥對進行DM相關網絡藥理學機制探討，可為烏梅的臨床用藥及后續開發研究提供有益線索。基于中醫藥數據挖掘與網絡藥理學分析可為進一步研究提供方向，但還需要進一步實驗驗證，從而更加系統、科學地闡述烏梅-人參防治DM的機制。