血清神經肽吻素水平在卵巢儲備功能減退不孕癥患者中的變化及其診斷價值

王金玉，陳圓輝，王倩，張嘯龍，張杰平，范英英，張翠蓮

(鄭州大學人民醫院，河南省人民醫院，鄭州 450003)

卵母細胞數量減少、質量降低，導致生殖能力下降，最終表現為生殖能力喪失或絕經，稱為卵巢儲備功能減退(DOR)。大約10%的不孕婦女患有DOR[1]，隨著經濟發展、女性生育年齡延遲等因素，利用輔助生殖技術(ART)助孕的DOR患者逐年增多，并且呈年輕化趨勢。因此，對于<35歲的年輕不孕女性，及早診斷DOR將有利于預測卵巢低反應，以期制定個體化治療措施達到盡早生育的目的。神經肽吻素(Kisspeptin)是調節女性生殖內分泌的關鍵神經肽，主要通過在上游調節下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌，進而調控下丘腦-垂體-性腺軸。研究表明，很多生殖內分泌疾病，如卵巢早衰(POF)、低促性腺激素性性腺功能減退癥、多囊卵巢綜合征、病理性高泌乳素血癥等，都與Kisspeptin的異常表達有關[2]。但是，Kisspeptin作為重要的生殖激素，其與DOR發病相關性的研究鮮有報道。因此，本研究擬采用酶聯免疫吸附(ELISA)試驗法檢測DOR患者血清基礎Kisspeptin(bKisspeptin)水平，并繪制受試者特征工作曲線(ROC)以探討其對DOR的診斷價值，以期為早期診斷DOR并制定合理的治療方案提供依據。

資料與方法

一、研究對象

收集2020年7月至2021年1月于我院生殖醫學中心首次經ART助孕的不孕癥患者的臨床資料，根據卵巢儲備功能檢查結果分為DOR不孕癥組(DOR組)和卵巢功能正常的不孕癥組(對照組)。

納入標準：(1)對照組患者要求均有排卵，月經周期正常，基礎性激素水平正常，月經第3天竇卵泡計數(AFC)7～20個，僅因輸卵管因素或男方因素導致不孕；(2)DOR組患者要求符合DOR診斷標準[3-4]：月經第3天(月經紊亂者可于超聲檢查未見優勢卵泡時)AFC<7個、抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、基礎卵泡刺激素(bFSH)≥10 U/L，3項中符合2項并排除輸卵管因素或男方因素導致不孕的患者。

排除標準：(1)存在染色體異常；(2)存在其他影響Kisspeptin水平的相關疾病，如子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥、多囊卵巢綜合征、低促性腺激素性性腺功能減退癥、高泌乳素血癥等；(3)近3個月內應用激素類藥物治療者；(4)糖尿病、甲狀腺功能亢進癥等內分泌代謝疾病患者。

共納入145例患者，其中DOR組80例，對照組65例。

本研究通過河南省人民醫院倫理委員會審核并批準。

二、研究方法

1.樣本收集：于月經周期第3天(月經紊亂者可于超聲檢查未見優勢卵泡時)，清晨空腹采集外周靜脈血 5 ml，于室溫靜置30 min，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清，置于-80℃冰箱內保存備用。

2.基礎激素水平檢測：血清bKisspeptin水平檢測采用ELISA試劑盒(上海藍基生物)，并按照說明書進行操作。將試劑和樣本緩慢恢復至室溫，酶標板中加入100 μl/孔待測樣本，在各孔中加入50 μl的酶標記溶液(不含空白對照孔)，37℃孵育反應1 h后充分清洗酶標板3～5次；用吸水紙徹底拍干酶標板后各孔加入顯色劑A、B各50 μl，20～25℃下避光反應10 min，各孔滴加50 μl終止液，立即用酶標儀(BioTek，美國)測量各孔450 nm的光密度值(OD)，并以PBS為空白對照，繪制標準曲線并計算待測樣本含量。血清AMH、bFSH、基礎黃體生成素(bLH)、基礎雌二醇(bE2)等性激素水平采用電化學發光儀(Elecsys e602，羅氏，瑞士)檢測。

三、統計學方法

采用 SPSS 21.0 軟件進行數據的統計分析。計量資料不符合正態分布，以中位數(四分位間距)[M(P25，P75)]表示，組間比較采用非參數檢驗；相關因素的分析采用Spearman相關性分析法；應用ROC曲線分析血清bKisspeptin的診斷效能。以P<0.05為有統計學意義。

結 果

一、患者一般資料比較

兩組間年齡和體質量指數(BMI)比較均無顯著差異(P>0.05)；DOR組血清bKisspeptin、bFSH、bLH水平均顯著高于對照組，而血清AMH、AFC、bE2水平均顯著低于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料比較[M(P25，P75)]

二、血清bKisspeptin水平與卵巢儲備功能指標的相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示，DOR患者血清bKisspeptin與bFSH、bLH水平呈顯著正相關關系(P<0.05)，與AMH、AFC呈顯著負相關關系(P<0.05)，與年齡、BMI、血清bE2水平無顯著相關關系(P>0.05)(表2)。

表2 DOR患者血清bKisspeptin與卵巢儲備功能指標的相關性

三、血清bKisspeptin及卵巢儲備功能指標對DOR的診斷效能

ROC曲線分析顯示，血清bKisspeptin診斷DOR的曲線下面積(AUC)為0.87，截斷值為418.42 pg/ml，敏感性68.75%，特異性89.23%；血清AMH診斷DOR的AUC為0.97，截斷值為1.17 ng/ml，敏感性87.50%，特異性95.38%；AFC診斷DOR的AUC為0.96，截斷值為7.00個，敏感性95.00%，特異性84.62%；血清bFSH診斷DOR的AUC為0.95，截斷值為7.24 U/L，敏感性93.75%，特異性89.23%，且均有統計學意義(P<0.05)(表3，圖1)。

表3 血清bKisspeptin及卵巢儲備功能指標對DOR的診斷效能

圖1 血清bKisspeptin及各卵巢儲備功能指標對DOR的診斷效能分析

四、不同年齡組中血清bKisspeptin水平對DOR的診斷效能分析

眾所周知，年齡是影響卵母細胞數量及質量的首要因素，也是卵巢反應性的獨立預測因子[5]。因此，本研究進一步根據患者年齡分為兩個亞組，即<35歲低齡組和≥35歲高齡組。

ROC曲線對比分析顯示，低齡組血清bKisspeptin診斷DOR的AUC為0.93，顯著大于高齡組的0.84和未年齡分組的0.87(P<0.05)；低齡組血清bKisspeptin鑒別DOR的截斷值為400.68 pg/ml，顯示敏感性73.53%、特異性96.55%(P<0.05)；高齡組血清bKisspeptin鑒別DOR的截斷值為316.92 pg/ml，顯示敏感性93.48%、特異性61.11%(P<0.05)(表4，圖2)。

表4 不同年齡患者血清bKisspeptin對DOR的診斷效能

A：低齡組；B：高齡組圖2 各年齡組血清bKisspeptin對DOR的診斷效能分析

討 論

DOR也稱卵巢儲備功能低下，以生育力下降、卵巢儲備功能指標變化、排卵障礙、月經不調、不孕為病理特征。近年來DOR患者越來越多，且呈年輕化趨勢，尋求ART治療的<35歲的年輕DOR不孕患者也逐漸增加，及早診斷DOR，將有利于預測卵巢低反應、制定個體化治療措施，達到盡早生育的目的[6]。另外，嚴重DOR患者的卵巢生殖功能會逐漸下降，發展為早發性卵巢功能不全(POI)，甚至發展為POF，導致女性生育力喪失或絕經。研究發現，DOR是連續的過程，其病程可分為4個階段：(1)基礎促性腺激素正常，但促排卵出現卵巢低反應為隱匿期；(2)基礎促性腺激素水平升高，促排卵出現卵巢低反應為生化期；(3)基礎促性腺激素顯著上升、生育能力顯著下降，并且出現月經不調，甚至伴隨因雌激素缺乏所致的一系列癥狀為顯性期；(4)原始卵泡處于不可逆的耗竭狀態的為POF期[7-8]。為了及早發現、早期干預卵巢功能減退的患者，歐洲人類生殖及胚胎學會在2016年發表指南[9]，將POF診斷前移，提出“POI”概念，并將bFSH的診斷閾值由40 U/L下調到25 U/L。我國2017年于《中華婦產科雜志》發表的專家共識提出“亞臨床期POI”概念，將bFSH診斷閾值下調為15～25 U/L[10]。實際上，bFSH的波動范圍非常大，即使是POI的患者，bFSH也有可能在正常范圍內，但當bFSH高達25 U/L時，使用ART治療的成功率己經很低。因此本研究納入DOR患者以bFSH≥10 U/L為診斷閾值，以期發現新的早期DOR診斷指標，以利于患者及時進行ART或生育力保存治療，并通過盡早干預，減緩其DOR的進程。

Kisspeptin是調節女性生殖內分泌關鍵信號因子，主要在GnRH神經元的上游起作用。下丘腦內Kisspeptin神經元位于下丘腦的弓狀核(ARC)和前腹側室周核(AVPV)。研究發現，ARC的Kisspeptin神經元主要接受E2的負反饋，AVPV的Kisspeptin神經元主要接受E2的正反饋。并且，ARC的Kisspeptin神經元不僅表達Kisspeptin，還共表達神經激肽B(NKB)和強啡肽(Dyn)，因此也被稱作Kisspeptin/神經激肽B/強啡肽(KNDy)神經元[11]。AVPV的Kisspeptin神經元和ARC的KNDy神經元共同調控GnRH的分泌，從而調控生殖軸[11]。目前，越來越多研究發現，生殖內分泌疾病與Kisspeptin異常表達有關，如低促性腺激素性性腺功能減退癥、多囊卵巢綜合征、病理性高泌乳素血癥等。翟君鈺[8]發現，POI和POF不孕女性的血清bKisspeptin顯著高于正常對照組。師紅美等[12]利用6周齡雌性balb/c小鼠建立POF模型，免疫組化結果顯示，POF小鼠卵巢次級卵泡中表達Kisspeptin的陽性細胞數比對照組顯著減少，提示Kisspeptin信號通路可能參與POF的發病機制。然而，張艷婷[13]研究發現，月經第2～3天DOR患者血清bKisspeptin水平與對照組比較無顯著差異，但該研究納入的樣本量較小，且部分患者基礎血清采集時期為口服避孕藥、孕激素撤退性出血的第2～3天，因此，無法排除激素類藥物對bKisspeptin水平的影響。另外，Zhai等[14]對正常育齡女性血清Kisspeptin在月經周期中的變化情況進行了監測，發現月經第3天血清Kisspeptin較低，而在月經期第11天時優勢卵泡生長約達1.2 cm時出現血清Kisspeptin峰值。最近，Abbara等[15]皮下注射Kisspeptin-54對女性患者進行促排卵治療，結果發現注射后卵母細胞成熟率增加，注射Kisspeptin-54的12 h內LH和孕酮水平激增，更進一步顯示了Kisspeptin參與促進卵泡發育成熟及誘導排卵。

鑒于DOR不孕女性的血清bKisspeptin水平鮮有研究，以及血清Kisspeptin水平與卵泡生長發育有一定關聯，本研究選擇在月經第3天(月經紊亂者可于超聲檢查未見優勢卵泡時)采集DOR患者血清測定bKisspeptin水平。本研究結果顯示，DOR組血清bKisspeptin水平與bFSH、bLH水平呈顯著正相關(P<0.05)，說明下丘腦分泌的Kisspeptin作為GnRH的上游調節因子參與調控bFSH和bLH的分泌。另外，本研究結果顯示，DOR患者血清bKisspeptin與AMH、AFC呈顯著負相關(P<0.05)，說明血清bKisspeptin可能與DOR密切相關。與對照組比較，DOR患者血清AMH、AFC、bE2水平顯著降低，而血清bKisspeptin、bFSH水平則顯著升高(P<0.05)，推測其可能作用于卵泡起始階段，由于DOR患者AFC數減少，其血清bE2水平降低，從而使得bE2的負反饋信號傳遞給ARC的KNDy神經元，KNDy神經元被激活后引起Kisspeptin、NKB、Dyn分泌增加，而此時Dyn誘發低頻率的GnRH脈沖導致血清bFSH分泌增加，刺激卵泡的募集和生長。關于血清bKisspeptin對DOR的診斷價值，本研究結果表示，未進行年齡分組時，血清bKisspeptin診斷DOR的AUC為0.87，顯著低于AMH、AFC、bFSH診斷DOR的AUC(P<0.05)。眾所周知，年齡是影響卵母細胞數量及質量的首要因素，也是卵巢反應性的獨立預測因子[5]。因此，本研究進一步根據年齡分組發現，<35歲患者的血清bKisspeptin診斷DOR的ROC-AUC為0.93，敏感度73.53%，特異度96.55%，提示血清bKisspeptin是一個較為理想的診斷標志物，尤其是對于<35歲的年輕DOR患者診斷效能更高。

由于本研究屬于單中心、小樣本研究，結論可能存在一定的偏倚，后期尚需要更多高質量、多中心、大規模的研究加以探討證實。

綜上所述，血清bKisspeptin水平檢測能夠為DOR患者的早期診斷提供理論依據，尤其對<35歲的年輕DOR不孕女性的診斷價值較高。DOR過程是不可逆的，與≥35歲患者相比，<35歲DOR患者行ART仍然可以獲得較好的臨床妊娠結局[16]。臨床上若發現患者不孕或月經紊亂，但是基礎促性腺激素尚未出現異常或異常程度較輕微，可通過檢測血清bKisspeptin水平協助預測其卵巢功能是否減退，為卵巢功能預測提供新的檢測指標。