卵胞漿內單精子注射技術精子優選方法的研究進展

邵帥，江梅，丁濤，姜經航，王開秀，王婷婷，向翠玲

(湖北省荊門市第二人民醫院 1.生殖醫學科；2.創傷-骨腫瘤外科，荊門 448000)

全球約有10%～15%的不孕不育夫婦，這些病例中約50%與男性有關，原因不明的男性不育的發生率約為15%[1]。卵胞漿內單精子注射(ICSI)是通過注射針將選擇的形態正常的單個精子注射到卵母細胞內使其受精的技術。自然受精是精子進入生殖道，去除精漿、穿透宮頸粘液、獲能、前進到輸卵管壺腹部，與卵子結合受精并通過一系列反應穿過卵丘細胞層、透明帶和卵膜等極其嚴格的選擇過程，就是為了選擇最有活力、DNA完整性好、成熟的精子與卵母細胞結合，得到高質量的胚胎[2]。ICSI則繞過了所有的自然選擇屏障(卵丘細胞層、透明帶和卵膜)。雖然ICSI對注射的精子要求比較高，通過將精子放大200～400倍，甚至放大到6 000倍觀察并選擇形態正常的精子，但只能有效選擇形態正常的精子，而有些形態正常的精子，其DNA完整性比較差，碎片比較多[3]。因此，從ICSI胚胎質量以及臨床結局角度考慮出發，本文從進行ICSI時精子的選擇方法作一綜述，以便為臨床ICSI提供有效參考。

一、低滲腫脹試驗

低滲透腫脹試驗(HOST)最初作為精子的診斷試驗，對精子質膜的功能完整性進行評估。在低滲條件下，精子尾部由于水的進入而出現正常的功能膜膨脹或卷曲，目前在臨床實踐中作為精子存活的可靠指標[4]。HOST可用于睪丸或附睪穿刺取出的精子、睪丸切開顯微取精的精子以及少弱精子癥患者手淫法取出的精子等，通過該方法可以篩選出完全不動但有活力的精子。Bloch等[5]通過HOST將精子按A到G進行分類，發現經HOST選擇的精子與未經選擇的精子相比較，HOST分類為B類和B+類的精子質量最高(低DNA碎片，低DNA去濃縮，端粒間距離短，染色體1區域小)。Casper等[6]通過HOST選擇不活動但有活力的精子，與隨機選擇精子相比，受精率從26%提高到43%，卵裂率從23%增加到39%。Charehjooy等[7]研究表明HOST的應用可以使胚胎具有更高的發育潛力、著床率以及妊娠率。此外，在IVF完全受精失敗的下一個ICSI周期中使用HOST，可以獲得更好質量的精子。

以上研究表明了HOST的有效性，并建議將其作為行ICSI之前的常規操作。盡管尚未有研究證明HOST的有害作用，但胚胎實驗室在決定使用HOST時，應該考慮其實踐運用、使用標準，并與患者簽訂相關知情協議。

二、激光輔助不動精子選擇

激光輔助不動精子選擇(LAISS)是在行ICSI之前高倍視野下選擇形態較好的不動精子，在靠近精子尾巴尖端處激光射擊，存活精子在射擊后精子尾部會立即出現卷尾或折角現象，但此方法不會對精子DNA造成損害。國內研究顯示LAISS能有效篩選睪丸中存活的不動精子，改善ICSI的實驗室結局，提高其正常受精率、優質胚胎率、囊胚形成率等[8]。LAISS可以有效鑒別極重度弱精子的存活情況，這些存活的極重度弱精子通過ICSI可以達到與正常精子ICSI相同的受精率，而且有助于提高卵裂率和優質胚胎率，但激光導致精子尾部卷曲的機制尚不清楚，可能與激光照射后介質流入精子尾部有關[9]。2017年報道了一例使用LAISS技術選擇的完全不動但存活的冷凍復蘇精子，進行ICSI受精后成功妊娠的病例，為數量較少的不動精子的處理提供了新的思路[10]。Ozkavukcu等[11]通過LAISS提取抗己酮可可堿的靜止精子進行ICSI，移植雙囊胚后獲得健康的三胞胎。也有其他研究顯示LAISS-ICSI與傳統的ICSI相比，雖然能夠提高卵母細胞存活率，但囊胚形成率、質量和利用率均下降[12]。

就目前文獻所顯示的沖突結果，LAISS-ICSI似乎不是提高ICSI成功率的最佳解決方案，仍需要大量的研究來證實LAISS-ICSI的成功率。也需要更多的研究和改進措施來闡明LAISS作為行ICSI前不動精子常規選擇的潛力及激光對胚胎發育的潛在影響機制。

三、偏振光顯微鏡選擇精子

成熟精子的細胞核具有固有的雙折射，偏振光顯微鏡就是根據精子雙折射現象對精子進行選擇。精子頭的雙折射可以作為反映其細胞核正常結構組織的指標。雙折射也可以評估頂體反應的狀態，因為成熟的精子在整個頭部表現出雙折射，而發生頂體反應的精子僅在頂體后區存在雙折射[13]。Magli等[14]發現位于頂體后區的雙折射與反應性頂體以及DNA完整性密切相關，是成熟精子的可靠指標。此外，雙折射模式與精子活力和正常形態之間有一定的相關性，形態異常或活力差的精子具有異常雙折射模式，且形態與雙折射特性的關聯性更強[14]。ICSI時選擇偏振光下存在雙折射的精子，受精后原核評分為Z1和Z2的顯著多于非選擇組，而且弱精子癥患者的精子行ICSI時，通過雙折射選擇精子得到的妊娠結局比HOST選擇的精子得到的妊娠結局更好[15]。2008年，Gianaroli等[16]利用雙折射選擇精子進行ICSI，與傳統ICSI方法相比，通過偏光顯微鏡選擇的精子可以獲得更好的胚胎發育和臨床結局。兩年后，該小組基于頂體完整性(發生頂體反應和未發生頂體反應的精子)及其與輔助生殖技術(ART)結果的關系評估了雙折射模式的作用，認為發生頂體反應的精子和未發生頂體反應的精子的受精率和胚胎發育均沒有顯著差異，但注射發生頂體反應的精子可以獲得更高的著床率和臨床妊娠率[17]。

盡管取得了這些成果，但還需要進一步的研究來驗證該方法。另外，對精子頭部雙折射模式的評估是基于形態學檢查，需要熟練的胚胎學家正確地執行這項技術。

四、運動精子細胞器形態學檢查

運動精子細胞器形態學檢查(MSOME)是一種通過超高倍顯微鏡將精子放大6 000倍后，對精子超微結構進行評估的技術。精子超微結構包括精子頂體、頂體后板層、細胞核、頸部、尾部和線粒體，其中精子的細胞核是影響ICSI結果的主要超微結構。由此在MSOME基礎上出現ICSI 的改良版，即形態選擇精子胞漿內單精子注射(IMSI)。IMSI已被證明是一種有效的技術，用于某些特定的患者群體的精子選擇。有研究比較了少弱精子癥和畸形精子癥的患者分別采取ICSI和IMSI技術的妊娠結局：與ICSI組相比，IMSI組患者的妊娠率和活產率有上升趨勢，生化妊娠率和著床率也較高[18]。史艷彬等[19]研究顯示，與ICSI相比，IMSI能夠提高優胚率，降低胚胎非整倍體率。與ICSI相比，IMSI所選精子的DNA碎片更少且凋亡轉錄基因水平更低，IMSI組的胚胎動力學和著床率、臨床妊娠率和活產率等臨床結局均要優于ICSI組[20]。

其他研究也顯示與ICSI相比，IMSI在不影響胚胎染色體狀態的前提下，顯著提高了胚胎質量和著床率，降低了流產率；由于IMSI在對精子的選擇過程中更準確，所以正常染色體的囊胚形成率高于ICSI。毫無疑問，IMSI技術的使用可以幫助一些不育夫婦生育孩子，但對于方法的效率以及如何執行IMSI的具體指南尚未達成共識。目前，不建議在ART項目中常規使用IMSI，IMSI僅適用于多次植入失敗的夫婦、嚴重男性因素致不孕的患者、高齡男性和高齡產婦等人群[21]。而且IMSI的臨床實踐沒有足夠的證據支持，需要進一步的試驗來闡明其有效性和安全性。

五、透明質酸介導的精子選擇

卵母細胞周圍含有透明質酸(HA)，成熟精子在質膜和體膜中表達HA結合糖蛋白，負責結合和消化HA。HA受體的表達可作為一種生物標志物，用于選擇和分離成熟精子進行ART。

基于HA介導的精子選擇技術有兩種，即生理性胞漿內單精子注射技術(PICSI)和富含HA培養基的篩選技術。PICSI技術是通過一個有HA涂層的培養皿進行ICSI；富含HA培養基的篩選技術是將一滴洗滌過的精子樣本放置在HA液滴附近，使兩液滴之間有一個接觸區，精子會停留在兩個液滴的界面，選擇其中結合了HA的精子進行ICSI。研究顯示通過HA結合實驗優選的精子，其正常形態率、獲能2 h酪氨酸磷酸化、誘發頂體反應以及核蛋白成熟度顯著增高，而DNA碎片率顯著降低[22]。在嚴重畸形精子癥夫婦中，PICSI組的受精情況和胚胎質量均顯著優于ICSI組[23]。2019年，一對夫婦使用通過HA結合的成熟圓頭形精子進行ICSI成功受孕，并成功分娩，嬰兒健康[24]。McDowell等[25]的研究表明，雖然沒有觀察到不良反應，但沒有足夠的證據來驗證HA選擇的精子可以改善ART結果，仍需要進一步的研究來評估HA為基礎的方法是否可以推薦用于臨床實踐。

六、磁性活化細胞分選法

磁活化細胞分選(MACS)是用磷酯酰絲氨酸與膜聯蛋白V(annexin-v)包被磁珠，進行凋亡與非凋亡精子的選擇。磷脂酰絲氨酸是一種帶負電荷的磷脂，存在于體細胞和精子的質膜內層，在細胞凋亡早期階段，它被外部化到細胞外層，與annexin-v結合。研究表明MACS技術可以有效地用于清除精子DNA碎片(SDF)較高的精子，MACS組在供卵周期中的妊娠率、自體和卵母細胞捐獻周期中的活產率均顯著提高，自體ICSI周期中的流產率降低，因此，MACS可能有助于改善ART結局[26]。有報道利用MACS技術從卡塔根氏綜合征患者射出的不動精子中優選精子，然后通過ICSI技術受孕并成功分娩健康嬰兒[27]。

Jeyendran等[4]研究顯示，與PICSI組比較，MACS組患者受精胚胎質量、著床率、臨床妊娠和持續妊娠率等均無顯著差異；根據女性年齡進行亞組分析時，年齡<30歲亞組中，MACS組的優質囊胚率、臨床妊娠率、持續妊娠率均顯著高于PICSI組(P<0.05)，但在30～35歲亞組中，PICSI組擁有較高的植入率、臨床妊娠率和持續妊娠率。但MACS是否有臨床實踐價值，以及關于哪些患者應該應用仍不確定。

七、電動電位法

成熟精子的膜具有-16～-20 mV的電位，這是由精子發生和附睪成熟過程中的唾液糖蛋白產生的，這種負電位可以作為成熟精子的標志物。隨著精子獲能，其電位下降，因此成熟的精子可以粘附在帶正電荷物體的表面。電動電位法就是基于這一原理，先將精液標本用培養基沖洗，再將精子懸液加到新的帶正電荷的玻璃離心管中(離心管置于乳膠手套內并旋轉2～3次，以獲得正電荷)，為使成熟精子有足夠的時間粘附于試管壁，將試管室溫靜置1 min，然后離心丟棄不粘附的精子，用含血清的培養基中和試管上的電荷，獲得成熟的精子。也可以使用商業化電動電位分析儀，通過施加電場，具有電荷的精子將向電極遷移，它們移動的速度與場強和電勢成正比。常規ICSI中精子選擇是基于形態和活力，這并不一定排除將DNA受損或凋亡的精子注射到卵母細胞中，電動電位法可以盡可能避免這一缺陷。

電動電位法和密度梯度離心法(DGC)回收的精子進行比較，兩種方法得到的精子的相對端粒長度和絕對端粒長度均無顯著性差異，但電動電位法制備的精子的平均DNA碎片率顯著低于DGC法[28]。DGC法和電動電位法的結合可以選擇磷酯酶Cζ(PLCζ)較高百分比的精子群體，這些精子包含大量的PLCζ并且染色質完整，這種精子選擇程序可以為以前受精失敗的不育男性開辟一種新的途徑[29]。與傳統DGC法相比，電動電位法不僅提高了胚胎質量，而且改善了妊娠結局；盡管電動電位法選擇后的X/Y比例相近，但電動電位組的出生性別比(XY/XX)顯著低于DGC組[30]。此外，電動電位法回收率低，導致其在少精子癥或睪丸穿刺精子回收的情況下使用有限[31]。

電動電位法的主要優點在于它的簡便和廉價，所選擇的精子DNA片段較少、形態正常、活力和運動性好。但仍需要更多的研究來闡明電動電位法是否改變了新生兒性別比例。

八、電泳法選擇精子

與電動電位法相似，電泳法選擇精子也是基于成熟精子的質膜帶負電荷。電泳法是將精液樣本置于電泳裝置中，然后施加電壓選擇帶負電荷的精子。電泳選擇精子技術可以根據精子的大小和負電荷，從未成熟、功能失調的生殖細胞和白細胞中分離出精子。該裝置包括兩個內室，用于精子的接種；兩個外室，用于收集選定的精子；兩個電極和兩個緩沖泵。內、外室由聚碳酸酯膜隔開，成熟的精子可以穿過，而較大的細胞被阻擋，這樣就可以獲取存活、活動、形態正常以及DNA損傷程度較低的精子。該方法適用于嚴重少、弱精子癥以及睪丸穿刺精子等的精子選擇。

電泳分離的精子活力和形態均優于Percoll梯度離心精子，生成的活性氧(ROS)更少，而且在睪丸或附睪穿刺精子中顯示出更低水平DNA損傷[32]。在對精子處理分析時，電泳法獲取的精子DNA損傷率低于DGC，獲取的精子質量與受精率、植入率和和囊胚發育呈正相關；而且有通過電泳法獲取高質量的精子受精后成功分娩的報道[33-34]。鑒于電動電位法對性別比例有一定的影響，Ainsworth等[35]也對電泳法的性別比例進行了研究，結果顯示電泳方法處理的精液，并沒有導致攜帶X或Y的精子的比例發生顯著變化。但有一些證據表明電泳法對精子活力存在負面影響，且使用電泳可能會引起一些安全問題[4]，故仍需要更多的研究來確定該方法在臨床實踐中的有效性。

九、精子的微流體分離

微流體是一種基于受控環境中亞微升水平上流體行為的物理和化學原理的新技術，這項技術用于遺傳學到ART技術的多個領域。微流體在精子選擇中的潛在效用已經取得了重大進展，研究顯示該技術從混合細胞懸浮液中回收精子的回收率>96%，大大提高穿刺取出精子的恢復時間，從人工觀察的幾個小時恢復提高到自動精子恢復的幾分鐘，處理時間提高了36倍；此外，精子微流處理對精子參數如精子的活力、形態以及DNA碎片沒有顯著影響；將微流體用于不動精子獲取可以極大地改進目前的睪丸精子提取的處理程序，簡化操作流程，從而保證手術成功[36]。微流體精子處理提供了一種替代傳統精子分離的技術，可以從未處理的樣品中分離出前向運動的精子，雖然通過微流體的處理會降低精子濃度，但改善了精子的運動性和活力以及降低精子DNA碎片率(DFI)水平，反映了該技術的高度選擇性[37]。

通過對微流體和直接上游法獲取的精子分別進行ICSI的移植結局比較，發現微流體獲得的精子受精后優質胚胎率較高，植入率以及臨床妊娠率均高于直接上游法[38]。Yetkinel等[39]顯示微流體系統的使用改善了胚胎質量，但與傳統的精子上游法相比，受精率、臨床妊娠率以及活產率并沒有顯著差異。需要進一步的研究來評估微流體的潛力及其在ART中的臨床應用。目前，這項技術大多以研究為主要目的，臨床應用的適用性較低。

十、總結

基于新的數據和對人類精子的更深理解，先進的精子選擇方法慢慢被開發出來，各種新技術都有其優缺點及適應證(表1)。新技術需要超越傳統精子選擇方法，解決更復雜的情況。盡管使用這些先進的精子選擇方法已經被證明可以改善ART結局，但大多數研究仍處于胚胎層面，隨后的發育和臨床結局需要進一步研究，以驗證其在臨床實踐中的有效性。

表1 精子優選方法的適應癥及優缺點