富血小板血漿宮腔灌注治療薄型子宮內膜的研究進展

任軍香，韓紅敬

(北京大學人民醫院婦產科生殖醫學中心，北京 100044)

薄型子宮內膜的定義尚無統一標準，臨床上推薦當子宮內膜厚度<7 mm時稱為薄型子宮內膜。而頑固性薄型子宮內膜定義為至少1次在胚胎移植(ET)周期中經過標準激素替代療法(HRT)內膜準備子宮內膜厚度仍<7 mm[1]。體外受精-胚胎移植患者(IVF-ET)中薄型子宮內膜發生率為2.4%[2]。子宮內膜厚度<7 mm的患者IVF臨床妊娠率為11%[3]，遠低于目前平均水平(30%～40%)，并與較高的流產風險有關[4]。薄型子宮內膜人群胚胎植入率低可能與子宮內膜血供較少、維持內膜正常形態的蛋白缺乏、支持細胞脆性增加致妊娠囊失去物理支撐而剝離等有關。患者體內低雌激素水平、先天的子宮畸形、既往宮腔操作史、盆腔感染引發的子宮內膜炎、長期服用避孕藥、長期不良生活習慣等均可導致薄型子宮內膜。目前臨床上常用大劑量雌激素補充，聯合低劑量阿司匹林、維生素E、血管活性藥物(如西地那非)、細胞集落刺激因子(G-CSF)以及神經肌肉刺激等[5]方法改善子宮內膜厚度及血流，但仍有部分頑固性子宮內膜薄型患者對以上方案不敏感。頑固性薄型子宮內膜的治療是臨床工作中亟待解決的問題。

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)被定義為“血小板濃度是正常水平的4～5倍的自體血液中的血漿成分”。PRP為自體外周靜脈血離心提取獲得。20世紀70年代即已開展了PRP應用于創傷修復中的研究，目前已廣泛應用：骨科在磨碎的骨移植物中添加PRP以提高成骨速率；整形外科在創傷性瘢痕修復、生發、游離皮片移植中的應用；皮膚科脫發、難愈性傷口的治療等。PRP的醫療價值與生物安全性得到了臨床的認可與驗證，但其在婦產科的應用仍在起步階段，自2015年起PRP改善薄型子宮內膜患者的臨床妊娠結局方面的研究開始出現。目前大部分研究結果顯示PRP可改善薄型子宮內膜的妊娠結局，小部分研究結果提示PRP改善薄型子宮內膜的作用不明顯。本文對此方向的研究進展進行綜述，以期促進研究者對薄型子宮內膜宮腔灌注PRP開展高質量研究，并推動薄型子宮內膜患者PRP宮腔灌注的臨床應用。

一、PRP的制備及優勢

Marx[6]將PRP中血小板的有效濃度定義為1×106/μl。通過提取血液制品成分促進組織再生和修復已有40余年的歷史，PRP的制備也經歷了一代和二代。其中二代PRP的制備較一代在功效和性價比方面有了質的提升。但目前臨床制備PRP的方式參差不齊[7]，有待統一。也有研究者認為盲目采用文獻中報道的離心方法是不可取的，需制定與具體的儀器設備相配套的制備方法[8]。

(一)PRP的制備方法

1.一代PRP的制備：在預裝有檸檬酸鹽抗凝溶液(ACD-A)的注射器中抽取一定量新鮮采集的外周靜脈血，通過離心去除血液的某些成分來增加血漿中血小板的濃度。添加血小板激活劑使血小板中的生長因子和細胞因子在凝血后10 min內激活并釋放，這些因子協同發揮調節細胞遷移、附著、增殖/分化以及促進細胞外基質積累的作用。全血采集量需根據所需PRP用量及患者基礎血小板濃度來評估。1 ml PRP的制備需要的全血量大約為5～10 ml，甚至更多[9]，一般宮腔灌注PRP課題需要制備5 ml左右。不同文獻中PRP的制備方法也不盡相同，包括離心速度、離心時間及離心次數的差異，主要影響PRP中不同成分的含量，從而影響PRP的功能。因此需要統一PRP的制備方法才能縮小因制備方法不同引起的對妊娠結局影響的誤差。

2.二代PRP的制備：以Choukroun離心方法[10]為標準，將采集的靜脈全血以2 700 r/min，離心12 min(亦有3 000 r/min離心10 min)的方式離心后分3層，上層為血小板貧乏的血漿(PPP)，中層為二代PRP，下層為紅細胞層。制備過程中應注意采血后立即離心；制備完成后立即進行宮腔灌注，其生物活性更高。

二代PRP又稱有白細胞的富血小板纖維蛋白(L-PRF)，它與一代PRP的不同點在于所含細胞成分比例及纖維蛋白構架不同。在離心的過程中離心速度越快則形成的纖維蛋白網越致密有序。二代PRP僅一次離心，一代PRP需要經過兩次較二代PRP速度低的離心，且第一次離心后會棄掉上層部分纖維蛋白原。因此二代PRP相較于一代有以下優勢：(1)能發揮更高的生物學效應。其內含白細胞及其他一些細胞因子能提高子宮內膜的抗感染及修復能力；(2)不需要額外添加鈣離子等促凝劑，僅一次離心，更方便省力且安全；(3)所含纖維蛋白原更豐富，形成的纖維蛋白網更堅固致密、不易被水解，發揮作用時間更久[11]。

(二)PRP的優勢

PRP富含多種生長因子，經激活后可以緩慢釋放、協同發揮作用，和單一的一次性釋放方式相比作用時間更長、具有更強的實際效果。同時，相關研究表明PRP不會造成細胞行為方式的改變，即不會導致細胞惡性變[12]，而且造成宮腔內感染的可能性也極低。此外，PRP來源于患者本身，減少了宮腔組織對因子的排斥作用；更容易獲得且成本更低；PRP雖屬于血液制品，但血液傳播疾病相關風險非常低。

二、 PRP治療薄型子宮內膜的研究進展

(一)PRP作用于子宮內膜的機制及基礎研究進展

PRP宮腔灌注的生物學效應可能與PRP中生長因子的促炎、趨化、促血管生成和抗凋亡作用有關。PRP中血小板濃度及各種生長因子如血小板源生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等[13]的濃度提升了4～5倍。這些因子在白細胞向損傷部位的募集、誘導和調節其他參與組織修復的細胞類型(如平滑肌細胞和間充質干細胞)的增殖和遷移、促進血管生成以及成纖維細胞的激活等方面發揮關鍵作用[14]。這些生長因子在PRP被激活的過程中通過脫顆粒的方式緩慢釋放，活化的細胞因子與內膜細胞上相應受體作用激活相關信號通路，可促進人子宮內膜上皮細胞、子宮內膜基質成纖維細胞、子宮內膜間充質干細胞、骨髓源性間充質干細胞的遷移、增殖和分化[15]，從而刺激腺體細胞及血管的增生，促進合成膠原蛋白原，修復損傷組織。除生長因子外，PRP中還含有纖維蛋白、纖維結合蛋白等蛋白質物質，形成纖維網絡，起到修復細胞、促進細胞黏附、防止細胞流失的支架作用[16]。

2018年一項PRP刺激子宮內膜細胞再生的體外試驗進一步探討了PRP和PPP對子宮內膜間質成纖維細胞(ESF)、子宮內膜間充質干細胞、骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)和Ishikawa細胞(IC)增殖、遷移和基因表達的影響[15]，該研究發現：活化的富血小板血漿(APRP)、非活化的富血小板血漿(NAPRP)、PPP均有促進子宮內膜細胞增殖和遷移的作用，但APRP的影響最大且作用最一致。另外，由于間充質干細胞(MSCs)中性激素受體的存在及其細胞外基質重塑的能力，MSCs是細胞外基質重塑、血管生成、細胞間通訊和絕經后組織修復的重要細胞成分。MSCs自噬水平降低被認為是BM-MSCs老化的機制之一。在此基礎上，Vishnyakova等[17]通過自體PRP與自體普通血漿和完全生長液對從子宮分離得到的MSCs的影響試驗，觀察到PRP處理后子宮內膜MSCs中自噬標志物LC3B蛋白的表達增加，提示PRP可通過促進自噬從而促進子宮內膜間質細胞的自我更新。

楊耀等[18]在衍生的PRP對子宮內膜間質細胞體外增殖影響的試驗中發現，37～41周新生兒臍靜脈血中血小板內因子PDGF-AB的含量高于同孕周孕婦外周靜脈血中PDGF-AB的含量，此研究還顯示低濃度的PRP可呈劑量依賴模式刺激細胞的增殖和遷移，超過一定濃度范圍則抑制細胞增殖，且2% PRP劑量時細胞增殖最強[19]。因此，PRP的劑量濃度與其臨床療效密切相關，提示找到最適宜宮腔灌注的PRP應用濃度臨床意義重大。

(二)PRP作用于子宮內膜的動物實驗研究

薄型子宮內膜動物模型(無水乙醇處理大鼠宮腔)內膜表面平整、腺體及血管不可見，內膜功能層菲薄幾近消失[20]。研究表明，將PRP灌注于經無水乙醇處理的大鼠宮腔中，既可提高標志子宮內膜容受性的相關蛋白，如波形蛋白(vimentin)、整合素β3、VEGF、同源盒基因-A10(HOXA10)以及細胞增殖相關的核蛋白Ki-67的表達，改善子宮內膜對胚胎的接納能力[20]；又可降低促炎癥細胞因子IL-1 mRNA的表達水平，降低炎癥反應[21]；還可提高子宮內膜波形蛋白的表達，維持子宮內膜細胞骨架的完整性[20]。經PRP宮腔灌注后大鼠宮腔內膜表面呈波浪型，可見腺體及小動脈增生。子宮內膜損傷導致腺上皮生長不良、子宮血流阻力高、血管生成不良，而PRP可促進子宮內膜損傷后子宮內膜腺體及血管的恢復，減少子宮內膜損傷后纖維化相關因子的表達，抑制子宮內膜纖維化的形成[22]。

(三)PRP治療薄型子宮內膜的臨床研究進展

Chang等[23]在2015年最先開展宮腔灌注PRP治療薄型子宮內膜的研究，納入5例既往子宮內膜反應差、應用HRT周期后子宮內膜厚度仍<7 mm的患者，于HRT周期的第10日進行PRP宮腔灌注，若72 h后子宮內膜厚度仍<7 mm則進行第2次灌注。結果5名患者子宮內膜厚度均增加，最終4名患者正常妊娠，1名因胚胎染色體異常流產。該研究為PRP改善薄型子宮內膜厚度方向的研究拉開了帷幕，也用實踐第一次證明了PRP宮腔灌注體內試驗的安全性。

有研究者比較了PRP和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)宮腔灌注對內膜薄且反復種植失敗(RIF)人群凍融胚胎移植(FET)周期妊娠結局影響，發現兩種方法在胚胎植入率、臨床妊娠率、活產率和流產率方面無顯著差異，改善作用相似[24]，但該研究樣本量較小，仍有待高質量的隨機對照研究驗證。另有研究在以上基礎上增加了生理鹽水宮腔灌注組，結果表明，與生理鹽水組相比，PRP及G-CSF宮腔灌注均促進薄型子宮內膜厚度增加及血流改善，但三者之間胚胎種植率、臨床妊娠率及早期流產率均未見明顯差異[25]。目前也有研究關注PRP宮腔灌注治療RIF人群的效果，認為宮腔自體PRP輸注是一種安全、廉價的優化子宮內膜的輔助治療，特別是對于有RIF病史的患者。因此RIF或頑固性薄型子宮內膜患者是PRP宮腔灌注的重點適用人群。目前大部分的臨床研究得出積極結論，即宮腔灌注PRP能改善薄型子宮內膜人群的妊娠結局。成慧等[26]設計的前瞻性研究顯示，FET周期中子宮內膜對HRT反應不良(周期第13天時子宮內膜厚度<7 mm)的女性，在FET周期的第13天將1 ml PRP注入子宮腔，如48 h后子宮內膜厚度未能增加，則在同一周期中重復PRP灌注；對照組僅接受HRT。與未進行宮腔灌注PRP的對照組相比，PRP組的子宮內膜厚度顯著增加 [(8.76±0.65) mm vs.(8.04±0.41) mm，P=0.001]，胚胎植入率(21.0% vs. 9.37%)和臨床妊娠率(40.5% vs. 20.0%)也顯著增高。另一項前瞻性隊列研究[27]結果表明，在HRT周期第10天和黃體酮給藥日分別經宮腔導管注入PRP，能有效改善子宮內膜厚度[(7.65±0.22) mm vs.(6.52±0.31) mm]、提高臨床妊娠率(44.12% vs. 20%)和胚胎植入率(27.94% vs. 11.67%)、降低周期取消率(19.05% vs. 41.18%)，以上結果均有統計學意義。此兩項研究代表了目前主流的PRP宮腔灌注時機，雖然PRP宮腔灌注的時機稍有差異，但均間隔2～5 d予PRP宮腔灌注，且均得出子宮內膜增厚、臨床妊娠率提高的結論。另一項納入83例患者的前瞻性研究認為PRP組的胚胎植入率和單周期臨床妊娠率均顯著高于對照組[28]。齊改梅等[29]的回顧性研究也得出相似的結論。關于PRP宮腔灌注的時機、重復PRP宮腔灌注是否優于單次灌注、2次PRP宮腔灌注最佳時間間隔等問題，仍有待進一步的研究加以闡明并進行驗證。

Coksuer等[30]回顧性研究觀察到，34例內膜形態不良的RIF患者給予PRP宮腔灌注治療，內膜厚度增加(10 mm vs. 6.25 mm，P<0.001)；與36例內膜形態良好不需PRP宮腔灌注的患者相比，臨床妊娠率(35.2% vs. 22.2%)和活產率(41.2% vs. 16.7%)均顯著提高(P<0.05)，而兩組間FET后的自然流產率和異位妊娠率相似。此項研究中PRP宮腔灌注不僅彌補了子宮內膜厚度的差異，提高了臨床妊娠率，甚至還提高了活產率，可能與血小板中釋放的多種細胞因子協同作用提高了子宮內膜容受性有關。活產率的提高是最終體現治療有效性的指標，目前尚缺乏PRP宮腔灌注治療薄型子宮內膜對活產率影響的研究。

三、未來展望

綜上所述，盡管宮腔灌注PRP改善薄型子宮內膜厚度以及改善臨床妊娠結局方面取得了一定的療效，但依舊存在很多的問題。例如PRP的制備標準、注射劑量、評價指標仍存在很大差異，尚無一致標準。標準化的PRP制備方案對于未來的研究中重現一致和準確的結果至關重要。此外，基礎研究證明了PRP在修復子宮內膜損傷的作用機制且發現作用效果與PRP的劑量濃度有關，但PRP在宮腔中作用的半衰期尚無文獻說明。臨床中部分患者進行一次宮腔灌注后子宮內膜厚度改善仍不理想者需第二次宮腔灌注，其中兩次灌注的時間間隔對于子宮內膜厚度的影響仍有待闡明。因此研究PRP的濃度梯度、宮腔灌注的次數與時間間隔對薄型子宮內膜的影響有利于完善PRP宮腔灌注的臨床應用。目前大部分的臨床研究樣本較小，某些對照變量未控制，且隨訪時間短，僅獲取臨床妊娠率，未隨訪活產率，因此對母兒最終妊娠結局的有效性、安全性及不良影響缺乏有力證據，最終導致臨床研究的證據級別較低。因此高質量、設計完善的隨機對照研究、體外試驗研究仍有待進一步補充完善，為臨床應用PRP宮腔灌注治療頑固性薄型子宮內膜提供更高質量的證據。