hsa-miR-221-3p 靶基因預測及生物信息學分析

李艷麗，譚仕廉，申元英，郭 樂

（大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000）

MicroRNAs（miRNAs）是進化上高度保守且廣泛存在于真核生物中的一類非編碼單鏈小RNA 分子，大小為19～25 個核苷酸，通過與信使RNA（mRNA）結合抑制靶基因的表達或翻譯來發揮轉錄后調控作用。目前大多數研究表明，miRNAs 在其靶mRNA 的3'UTR 處與特定序列結合，在轉錄后水平誘導靶基因失活降解或蛋白質翻譯抑制。研究表明[1，2]，miRNAs 在多種類型的癌癥中差異表達。全基因組分析表明[3]，50%的miRNA 基因位于與癌癥相關的基因組區域或脆弱位點，其中一些已被確定為致癌基因或腫瘤抑制基因，如與瘤周淋巴管生成和淋巴結轉移相關的miR-221-3p，其被發現在腫瘤轉移進展中發揮作用。人類miR-221-3p（hsa-miR-221-3p）最初是自2003 年被Lim LP 等[4]團隊在斑馬魚中克隆獲得并得到證實的，同年另一團隊[5]從老鼠神經元細胞中克隆獲得了此基因，2004 年在人類白血病細胞HL-60中該基因又得到進一步證實。miR-221-3p 在多種實體瘤和血液系統腫瘤進展過程中異常表達[6-9]，如肝癌、胃癌、肺癌、成神經管細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、急性髓系白血病等，其發揮著類似癌基因的作用[10-13]。這提示hsa-miR-221-3p 在腫瘤的發生中發揮某些密切調控作用，這可能會為腫瘤的治療提供新的靶點，因此有必要深入了解hsamiR-221-3p 的調節機制。本研究擬通過生物信息學分析方法預測提取hsa-miR-221-3p 靶基因數據交集，并對其進行GO 功能分析及KEGG 信號轉導通路富集分析，為hsa-miR-221-3p 及其靶基因在腫瘤發生發展中的調控機制提供理論基礎和研究線索。

1 材料與方法

1.1 hsa-miR-221-3p 的基因定位和物種序列保守性的預測分析 利用在線檢索UCSC（http://genome-asia.ucsc.ed）數據庫檢索hsa-miR-221-3p 的基因序列號、染色體定位和基因位點等基本信息；利用miRBase（https://www.mirbase.org/）在線數據庫檢索hsa-miR-221-3p 成熟序列并分析其保守性。

1.2 hsa-miR-221-3p 在人類各組織中的表達分析運用miGator v3.0 數據庫（http://mirgator.obic.re.kr/）檢索hsa-miR-221-3p 在人類不同組織器官中的表達量，并且進行預測分析。

1.3 hsa-miR-221-3p 的靶基因預測 通過Target Scan（http://www.targetscan.org/vert71/）、miRDB（http://www.mirdb.org/）和miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）靶基因數據庫在線預測hsa-miR-221-3p 的靶基因，對3 個數據庫的預測結果繪制維恩圖，得到交集靶基因。靶基因預測是遵循序列互補這一基本原理，miRNA 的“種子序列”靶基因的3’UTR 通過堿基配對的方式結合。

1.4 hsa-miR-221-3p 預測靶基因的GO 和KEGG 富集通路 將hsa-miR-221-3p 預測的交集靶基因利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫進行GO分析和KEGG 信號通路富集分析。GO 分析包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學過程（biological process，BP）3 個方面；KEGG 富集分析用于分析hsa-miR-221-3p 的34 種交集靶基因KEGG 的富集程度。

1.5 hsa-miR-221-3p 靶基因編碼蛋白質之間相互作用分析 為了對交集靶基因進行所編碼蛋白質之間的相互作用分析，將3 個數據庫預測hsa-miR-221-3p 的交集靶基因數據集導入String 11.0 數據庫（http://www.string-db.org），構建靶基因編碼的蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡圖。

2 結果

2.1 hsa-miR-221-3p 的基因定位和成熟序列的保守性分析 在線檢索UCSC 數據庫發現hsa-miR-221-3p基因序列號為MIMAT0000278，定位于人類基因組chrXp11.3 染色體，其基因位點在chrX:45746181-45746202 之間，見圖1。通過miRBase 數據庫檢索hsa-miR-221-3p 成熟序列并分析其物種保守性，結果顯示hsa-miR-221-3p 的成熟序列為“AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC”，此序列在15 種物種間基本一致，該序列在15 種物種進化過程中具有高度保守性，hsa-miR-221-3p 可能具有潛在的生物學功能，見表1。

表1 不同物種中miR-221-3p 的成熟序列

2.2 hsa-miR-221-3p 在人類各組織中的表達分析hsa-miR-221-3p 在人體部分組織器官中的表達分析情況見圖2，其中肺組織中表達量較高，在其他組織中表達量相對較低。

2.3 hsa-miR-221-3p 的靶基因預測結果 利用TargetScan、miRDB 和miRTarBase 這3 種在線數據庫預測到hsa-miR-221-3p 的靶基因數量分別為497、615 和249 個。然后通過在線軟件Venny2.1 對上述3 個數據集繪制韋恩圖推導得到交集靶基因共34個，見圖3；具體靶基因見表2。

表2 hsa-miR-221-3p 調控的靶基因數據集

圖3 TargetScan、miRDB、miRTarBase 數據庫預測hsa-miR-221-3p 的靶基因

2.4 hsa-miR-221-3p 靶基因GO 功能分析 hsamiR-221-3p 的交集靶基因主要存在細胞的多個組分，包括多聚核糖體、細胞核和線粒體外膜等細胞組分，見表3；hsa-miR-221-3p 的交集靶基因執行多種分子功能，主要包括調控泛素蛋白連接酶的活性、DNA 結合和RNA 合成調控等分子功能，見表4；參與內在凋亡信號通路的正向調控、mRNA 加工等多種生物過程，見表5。

表3 hsa-miR-221-3p 預測靶基因的細胞組分

表4 hsa-miR-221-3p 預測靶基因的分子功能

表5 hsa-miR-221-3p 預測靶基因的生物過程

2.5 hsa-miR-221-3p 靶基因KEGG 通路富集分析對hsa-miR-221-3p 的交集靶基因KEGG 通路富集分析發現，參與癌癥調控的靶基因有5 個，參與PI3K-Akt 信號通路的靶基因有4 個，見表6。

表6 hsa-miR-221-3p 預測靶基因的KEGG 信號通路分析

2.6 hsa-miR-221-3p 靶基因編碼蛋白質之間相互作用分析 PPI 結果顯示，hsa-miR-221-3p 的靶基因編碼的蛋白質之間形成了復雜的網絡互作圖，見圖4。與其他蛋白存在較強作用關系的靶基因為BCL2L11、ESR1、FMR1。

圖4 預測靶基因所編碼蛋白質之間的相互作用分析

3 討論

癌癥是目前造成人類過早死亡的主要原因之一。據估計，到2030 年，癌癥患病率可能會增加到2600 萬人左右，并將導致1700 萬人死亡。癌癥可對患者的生活質量產生嚴重影響，給各國帶來嚴重的經濟負擔[14]。目前大量研究表明[15-17]，癌癥的發生發展中常常伴隨多種miRNAs 的異常表達。hsamiR-221-3p 作為致癌基因參與多種腫瘤的形成過程，又因為其在特定癌細胞中過表達，已經成為實體瘤和血液系統腫瘤診斷、治療和預后的潛在生物標志物[12，13，18]。但是hsa-miR-221-3p 在一系列的惡性腫瘤中的作用機制尚不明確，目前對hsa-miR-221-3p 潛在靶點和相關通路的分析尚不全面。本研究利用生物信息學相關的在線數據庫對hsa-miR-221-3p 在人體組織器官中的分布進行分析，預測hsa-miR-221-3p 的靶基因，同時取得了3 種數據庫預測的交集靶基因，還對其相關的GO 功能和KEGG 信號通路進行富集分析。

本研究結果表明，hsa-miR-221-3p 的成熟序列在已知的15 個物種中高度保守，因此推測hsamiR-221-3p 具有重要的生物學潛能。hsa-miR-221-3p 在多種組織器官的分布分析表明，它在肺部組織中高度富集表達。另外3 個數據庫聯合預測獲得的34 個交集靶基因廣泛存在多聚核糖體、細胞核、線粒體外膜等細胞的5 個組分，并且執行調控泛素蛋白連接酶的活性、DNA 結合和RNA 合成調控等9 種分子功能，同時hsa-miR-221-3p 參與內在凋亡信號通路的正向調控、mRNA 加工等15 多種生物過程。另外，其交集靶基因顯著富集于癌癥通路和PI3K-Akt 信號通路。PPI 結果顯示，hsa-miR-221-3p 的交集靶基因編碼的蛋白間形成了復雜的網絡圖，BCL2L11、ESR1、FMR13 等3 種靶基因編碼的蛋白質間存在較強的作用關系。

miR-221-3p 在大多數實體瘤和血液系統腫瘤的癌細胞系和腫瘤組織樣本中異常表達，發揮著致癌或抑癌作用。miR-221-3p 通過靶向調控細胞周期調節因子p27 的表達，使得細胞周期進程加快，促進癌細胞增殖、集落形成和侵襲，成為非小細胞性肺癌細胞生長的一種新的調控因子[19]。但是當miR-221-3p 和miR-126-3p 聯合作用于下游靶基因PIK3R2 和PTEN，共同阻斷AKT 和CXCR4 信號通路時可發揮抗腫瘤功效[17]，這表明miR-221-3p 對肺癌的調控作用還需要進一步探究。miR-221-3p在胃癌細胞系和腫瘤樣本中均高表達，通過抑制PTEN 的表達促進胃癌細胞的增殖和侵襲，發揮致癌作用[7]。另外，相對單一miR-221-3p，與miR-122-5p 聯合檢測對胃癌的診斷和預后具有更重要的臨床價值[16]。血管生成作為腫瘤進展的關鍵，是治療晚期宮頸癌的重要靶點，宮頸鱗狀細胞癌中miR-221-3p 通過下調THBS2 促進血管生成和宮頸癌淋巴結轉移[20，21]。由骨髓間充質干細胞來源的微囊泡傳遞的miR-221-3p 通過靶向CDKN1C 促進急性髓細胞白血病細胞周期、細胞增殖和侵襲，發揮致癌作用。

不同于上述miR-221-3p 發揮顯著致癌作用，Wu Q 等[10]首次揭示miR-221-3p 靶向ARF4 可抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖和遷移，發揮抑癌作用，因此miR-221-3p 表達水平恢復可能是上皮性卵巢癌患者的一種潛在的治療策略。另外，miR-221-3p的下調及其靶基因PARP1 的上調與三陰性乳腺癌的預后不良密切相關，可作為其預后診斷的生物標志物[11]。miR-221-3p 除了在卵巢癌外，在成神經管細胞瘤中同樣發揮抑癌作用，miR-221-3p 可通過靶向下調EIF5A2 誘導細胞周期阻滯和凋亡來降低髓母細胞瘤細胞增殖，提示miR-221-3p 可能是成神經管細胞瘤診斷和治療的潛在候選靶點。另外miR-221-3p 在12.3%的MGMT 啟動子-未甲基化的膠質母細胞瘤病例中表達上調，是不良預后的潛在生物標志物[22]。miR-221-3p 除了在以上惡性腫瘤中發揮癌基因的作用，對周圍神經損傷、心力衰竭和糖尿病性視網膜病變等基礎疾病中亦發揮重要調節作用[23-25]。由此可見，進一步深入研究miR-221-3p 的強大調控功能及其作用機制是非常有必要的。

綜上所述，miR-221-3p 與人體多種癌組織和癌細胞的活力和動力密切相關，miR-221-3p 對腫瘤細胞增殖的調控作用取決于癌癥類型，調控miR-221-3p 及其靶基因的表達有望成為惡性腫瘤診斷、治療和預后的一種新的生物標志物和治療靶點。