馬鈴薯StASR基因的生物信息學分析及基因克隆

王樹林 李高峰 張榮 文國宏 李建武

摘要：將擬南芥AtASR基因核苷酸序列作為查詢序列，在NCBI數據庫中進行BLAST比對，得到馬鈴薯StASR基因（GenBank登錄號：XM_006359742）的序列。通過生物信息學分析發現，該基因位于4號染色體上，基因長度為654 bp，編碼108個氨基酸殘基，其編碼的蛋白質具有典型的ABA/WDS保守結構域。啟動子區域分析后發現，馬鈴薯StASR基因含有水分響應元件MYCATERD1、冷脅迫響應元件DRECRTCOREAT和鹽脅迫響應元件GT1GMSCAM4等多種與非生物脅迫響應相關元件以及馬鈴薯生長發育相關順式作用元件，對其進行蛋白質互作網絡的分析發現與低溫、水分脅迫等基因互作。用PCR技術成功的克隆到馬鈴薯StASR基因，其結果可以為深入研究馬鈴薯StASR基因的功能提供基礎。

關鍵詞：ASR基因;干旱脅迫;馬鈴薯;生物信息學

中圖分類號：Q781;S532? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2022）03-0020-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.03.005

Bioinformatics Analysis and Cloning of the StASR Gene in

Solanum tuberosum

WANG Shulin 1， 2， LI Gaofeng 1， 2，? ZHANG Rong 1， 2， WEN Guohong 1， 2， LI Jianwu 1， 2

（1. Institute of Potato， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. National Germplasm Resources Agricultural Experimental Station， Weiyuan Gansu 748201， China）

Abstract：In this experiment， the sequence of the potato StASR gene（Genbank Accession number：XM_006359742） was obtained by BLAST comparison in NCBI database using the nucleotide sequence of the Arabidopsis AtASR gene as the query sequence. Bioinformatics analysis revealed that the gene was located on chromosome 4 with a length of 654 bp and encodes 108 amino acid residues， and the encoded protein has a typical ABA/WDS conserved domain. After analyzing the promoter region， it was found that the potato StASR gene contains water response element MYCATERD1， cold stress response element DRECRTCOREAT， salt stress response element GT1GMSCAM4 and other abiotic stress response related elements as well as potato growth and development related cis-acting elements. The analysis of protein interaction network found that it interacted with genes such as low temperature and water stress. In addition， the potato StASR gene was successfully cloned by PCR technology， and the results can provide a basis study of the function of the potato StASR gene.

Key words：ASR gene;Drought stress;Potato;Bioinformatics

植物在生長發育的過程中生長環境對其產生重大的影響。為應對環境中的各種非生物脅迫，植物自身發展出了復雜的調控網絡來適應環境帶來的影響[1 ]。盡管越來越多的非生物脅迫調控網絡被鑒定出來，但許多功能機制還尚未完全明確。

ASR蛋白是一類高等植物中特有的蛋白質，具有小而親水的特征[2 ]。第一個ASR蛋白在番茄（Solanum lycopersicum L.）中被分離出來后[3 ]，越來越多的植物中，如百合（Lilium L.）、葡萄（Vitis vinifera L.）、水稻（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）中也相繼鑒定到ASR基因[4 ]。研究發現ASR蛋白具有典型的由60～80個氨基酸殘基構成高度保守的ABA/WDS（abscisic acid/water deficit stress） 結構域，并且在N端具有鋅指結合位點。ASR蛋白能夠以單體或者復合體的形式與特定的DNA結構結合[5 ]。雖然在多種作物中已經克隆到ASR基因，但其ABA/WDS結構域的功能并不明晰，其蛋白質由70～230個氨基酸殘基組成[6 ]。具有ABA/WDS結構域的蛋白質復合物能夠響應干旱脅迫、鹽堿脅迫、低溫脅迫。在干旱脅迫的調控中能夠響應依賴于ABA的調控途徑[7 ]，在低溫脅迫的調控中以分子伴侶的形式進行調控。另外在植物生長發育的各個時期也具有重要的調控作用，如在花粉發育、果實成熟和植株衰老的過程中表達量都有顯著變化[8 ]。在干旱脅迫相關研究中，將ASR基因在水稻中進行超表達后發現轉基因水稻的耐旱能力得到大幅提升，其中ASR3也成為水稻耐旱關聯圖譜的候選基因[9 ]。將外源ASR基因在擬南芥中進行超表達也提高了擬南芥的耐旱性和耐鹽堿性[10 ]。有研究證實，在水稻中ASR蛋白在干旱響應調節通路中通過減輕細胞膜損傷，保持水分含量來提高作物的耐旱性[9 ]。然而，ASR蛋白是否在滲透脅迫下作為一個調控因子通過激活植物抗氧化系統和其他脅迫相關的基因開始轉錄來參與ROS穩態的調節目前還尚未闡明。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界上主要的糧食作物，非生物脅迫如干旱、鹽堿、低溫均對其植株生長發育和塊莖的膨大具有較大的影響[11 ]。盡管有研究表明ASR蛋白在馬鈴薯塊莖中響應鹽堿脅迫，但該基因在干旱和鹽堿脅迫中的信號通路機制尚不清楚[12 ]。我們分析了馬鈴薯StASR基因的結構和蛋白質互作網絡，以期為進一步研究StASR基因在逆境脅迫響應網絡中的功能提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

試驗所用的PCR 酶、T4連接酶、限制性內切酶和pMD18-T載體等均購自大連寶生物公司。RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自TANGEN公司。指示馬鈴薯品種為大西洋。盆栽馬鈴薯在溫室中的生長條件為：生長溫度（24±2） ℃，白天/夜晚光照周期為16/8 h。取樣后立即用液氮處理并存儲于-80 ℃ 冰箱。

1.2? ?生物信息學分析

將擬南芥AtASR基因作為同源序列在NCBI中進行BLAST比對，得到馬鈴薯StASR基因序列。將得到的馬鈴薯StASR基因的全基因組序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行BLAST同源比對，找到相似度較高的其他物種ASR基因序列做進化樹。StASR基因在染色體上所處的位置分析使用馬鈴薯數據庫（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download. shtml）。啟動子分析采用在線網站（https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action= newplace）。蛋白質一級結構分析采用ExPAy （https：//web.expasy.org/protparam/）。蛋白互作網絡分析采用在線網站（https：//string-db.org/）。

1.3? ?馬鈴薯總RNA的提取及StASR基因的克隆

對供試馬鈴薯品種大西洋進行取樣后，提取馬鈴薯總RNA，反轉錄成cDNA作為DNA克隆模板。根據馬鈴薯StASR 基因序列設計PCR克隆引物，正向引物為StASR-F：CGCGGATCCACAACA TTATCTCATCACTCACGC;反向引物為StASR-R：CGG GGTACCTCAAGCACTCTGAAGGGAAAC。用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后將PCR產物進行膠回收。

2? ?結果與分析

2.1? ?馬鈴薯StASR基因及其蛋白質分析

生物信息學分析表明，馬鈴薯StASR基因位于馬鈴薯第4號染色體上，基因長度654 bp，放閱讀框長度為327 bp。NCBI Splign分析結果（圖1）顯示，StASR蛋白結構分析發現包含有典型的ABA/WDS結構。采用蛋白質分析在線軟件分析蛋白一級結構發現，蛋白質化學式為：C538H819N165O158S1，該蛋白由108個氨基酸殘基構成。分子量為12 158.49 Da，理論等電點為6.65，其中含量較高的氨基酸有Glu、His和Lys，都達到了16.7%;含量較低的氨基酸有Gln和Met，僅占0.9%。另外分析發現有21個帶負電的氨基酸殘基（Asp + Glu），帶正電的（Arg + Lys）共有18個。蛋白質不穩定系數為46.37，將該蛋白性質歸類為不穩定蛋白質。

2.2? ?馬鈴薯StASR基因進化分析

通過NCBI進行BLAST得到7個物種與馬鈴薯StASR基因同源性較高的蛋白序列。通過MEGAX軟件使用NJ鄰進法構建分子系統進化樹（圖2）。結果顯示，馬鈴薯StASR基因與番茄具有高度相似的進化關系，與黃瓜與鳳梨的次之，與水稻及玉米的進化關系最遠。分析結果與馬鈴薯進化關系基本相一致。

2.3? ?馬鈴薯StASR基因的啟動子區分析

對基因啟動子上游序列1 000 bp的區域進行分析發現，馬鈴薯StASR基因包含不同的順式作用元件，如脫落酸（ABA）響應元件ABREZMRAB28。脫水響應元件ABRELATERD1。與非生物脅迫響應的相關元件，如水分響應元件MYCATERD1、冷脅迫響應元件DRECRTCOREAT、鹽脅迫響應元件GT1GMSCAM4。另外還包含一些與光調節相關的順式作用元件，如元件GT1CONSENSUS和較多的DNA結合元件ARR1AT（表1）。這些元件顯示馬鈴薯StASR基因可能在其逆境脅迫機制中發揮重要作用。

2.4? ?馬鈴薯StASR基因的克隆

以供試馬鈴薯品種大西洋提取RNA后反轉錄合成cDNA為模板進行基因PCR擴增。擴增引物根據馬鈴薯StASR基因序列設計，PCR擴增引物為：正向引物為StASR-F：CGCGGATCCACAACATTAT CTCATCACTCACGC;反向引物為StASR-R：CGG GGTACCTCAAGCACTCTGAAGGGAAAC。PCR擴增結束后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳得到長度為570 bp左右長度的DNA片段（圖3），其大小符合預期。將PCR產物進行回收，回收目的片段通過T4-DNA連接酶將其連接在克隆載體上。

2.5? ?馬鈴薯StASR蛋白互作網絡分析

通過在線軟件STRING進行馬鈴薯StASR蛋白互作網絡分析（圖4）顯示，馬鈴薯StASR蛋白與脂質轉運相關蛋白（putative LTP）、磷酸酶蛋白、生長素響應蛋白（IAA4）、泛素連接酶蛋白、低溫響應蛋白、肽酶、硝酸鹽蛋白具有互作作用，說明馬鈴薯StASR蛋白能夠參與到生長發育和逆境脅迫響應當中。

3? ?結論與討論

通過生物信息學的方法分析了馬鈴薯StASR基因與其他物種中的同源基因，從基因結構、啟動子區域分析、蛋白理化性質、物種進化關系、蛋白互作網絡5個角度分析表明，該基因位于4號染色體上，基因長度為654 bp，編碼108個氨基酸殘基，其編碼的蛋白質具有典型的ABA/WDS保守結構域，并且在進化關系上與番茄高度相似，說明馬鈴薯StASR基因在與茄科作物進化分歧前就發生復制現象，起源較早[13 ]。啟動子區域分析后發現，馬鈴薯StASR基因含有水分響應元件MYCATERD1、冷脅迫響應元件DRECRTCOREAT和鹽脅迫響應元件GT1GMSCAM4等多種與非生物脅迫響應相關元件，對其進行蛋白質互作網絡的分析發現與低溫，水分脅迫等基因互作。另外用PCR技術成功的克隆到馬鈴薯StASR基因，其結果可以為深入研究馬鈴薯StASR基因的功能提供基礎。啟動子區分析和蛋白質一級結構分析發現其基因上游區間有水分、低溫、鹽堿脅迫相關的響應元件，表明馬鈴薯StASR基因能夠參與到逆境脅迫響應的通路當中。另外在蛋白質互作網絡分析中發現馬鈴薯StASR蛋白能與低溫、干旱和生長發育相關的10個蛋白質互作，也說明其能夠調節作物響應逆境脅迫的能力。

馬鈴薯是我國第三大糧食作物和四大主糧作物之一[14 - 15 ]。馬鈴薯StASR基因雖然結構簡單，但其廣泛的參與到馬鈴薯對逆境脅迫響應信號通路中，對馬鈴薯抗旱調節具有重要的潛在作用[16 ]。我們僅對馬鈴薯StASR基因在基因結構、蛋白功能方面進行了分析，其在調控網絡中的具體作用機制還需要進一步的研究。在干旱脅迫中依賴于ABA或者獨立于ABA的信號通路中都有ASR基因參與。在水分脅迫下，番茄SlASR基因與百合ASR基因表達量顯著升高[17 ]。 草莓FaASR基因與葡萄VsASR基因在外源ABA處理下都有顯著的升高[18 - 19 ]。另外有研究表明，病原菌也會誘導ASR基因的表達，如樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）、枯萎病菌（F. oxysporun f. sp. Cubense）能夠使ASR基因或者同源蛋白的表達量增高[20 ]。在不同作物的不同生長發育時期ASR基因的表達模式也不相同。番茄中果實在成熟期SlASR2基因表達量下降，草莓果實轉色后基因表達量上升，葡萄從坐果期到成熟期VvASR基因的表達量先升高后降低[21 ]。將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒CP融合基因導入馬鈴薯，并對影響遺傳轉化的因素進行了優化[22 ]。

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收稿日期：2021 - 11 - 24;修訂日期：2022 - 01 - 09

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31760410）;甘肅省種業攻關項目（GZGG-2021-4）;現代絲路寒旱農業馬鈴薯產業發展項目（GNKJ-2020-1）;甘肅省農業科學院生物育種專項（2020GAAS10）。

作者簡介：王樹林（1992 — ），男，甘肅古浪人，研究實習員，碩士，研究方向為植物分子生物學。聯系電話：（0931）7706264。Email：1825631205@qq.com。