非小細胞肺癌患者腫瘤組織中驅動基因的分子病理檢測分析及其臨床意義

左安欣，張曉妹，仇 瑋

(南京市江寧醫院病理科，江蘇 南京 211100)

肺癌是全世界發病率和死亡率均為最高的腫瘤[1]，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%[2-4]。肺癌傳統的治療方法總體預后較差，5年生存率低于20%[5-8]。近年來，研究發現，某些基因的突變可驅動肺癌的發生發展，即肺癌的驅動基因。針對 NSCLC的常見驅動基因(如 EGFR、ALK、ROS1、RET、BRAF、HER-2和MET 等)研究出了相應的靶向治療藥物，明顯延長了肺癌患者中位生存期，并使其療效得到顯著改善[8-9]。這些驅動基因的研究為個體化治療及靶向治療的推廣奠定了基礎。美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南明確指出，在進行靶向治療前需要對基因的突變狀態進行檢測，并建議對更廣泛的有效基因進行檢測[10]。因此，多基因聯合突變檢測可以為臨床靶向治療提供更有效、更精準的治療方法。鑒于此，本研究采用探針擴增阻礙突變系統PCR(ARMS-PCR)法檢測83例 NSCLC患者驅動基因突變情況，并分析其基因突變與患者臨床病理參數的關系，為判斷疾病發展過程、預后及靶向治療提供分子病理學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南京市江寧醫院病理科2020年1月至2021年7月經手術切除、穿刺、活檢及胸腔積液等NSCLC 樣本83例，其中腺癌76例，鱗癌4例，未分化癌1例，肉瘤樣癌2例，其病理診斷明確為NSCLC，且患者無血液系統疾病、免疫缺陷疾病及其他惡性腫瘤等嚴重影響研究結果的病癥，同時有足夠的腫瘤細胞進行后續分子病理檢測。

1.2主要試劑和儀器 核酸提取試劑盒、10種(ALK、ROS1、RET、EGFR、KRAS、HER-2、PIK3CA、NRAS、MET和BRAF)突變基因檢測的試劑盒(熒光PCR法)均由廈門艾德生物公司提供。熒光定量PCR儀為宏石SLAN-48P/96S，杭州奧盛Nano-300紫外分光光度計。

1.3方法 根據蘇木素-伊紅(HE)染色，先在顯微鏡下圈出腫瘤區域，將腫瘤區域的蠟塊切成蠟卷，每個腫瘤樣本總共收集2管，分別用于DNA和RNA的提取。嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。提取后，用紫外分光光度計測量DNA/RNA質量及濃度，將濃度稀釋至2～5 ng/μL備用。福爾馬林固定石蠟包埋的組織DNA、RNA提取試劑盒(EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER-2九基因聯合檢測試劑盒)和MET突變檢測試劑盒。具體操作步驟嚴格參照說明書進行，體系將在實時熒光定量PCR儀中進行擴增。

1.4統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統計學處理。應用Pearson卡方檢驗，連續校正的卡方檢驗及Fisher精確概率法分析基因突變與臨床病理特征的相關性，所有P值均基于雙向假設檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.110種基因突變分布 檢測的83例標本中，10種基因總突變率為74.70%(62/83)。41例出現了EGFR突變(49.40%)，其中19例為19號外顯子缺失(19-Del)，15例為21號外顯子基因突變(L858R)，3例為20號外顯子插入突變(20-Ins)，3例為18號外顯子G719X突變，1例為21號外顯子L861Q突變。4例出現ALK基因融合突變(4.82%)，4例出現ROS1基因融合突變(4.82%)，11例出現KRAS基因突變(13.25%)，3例出現HER-2基因突變(3.61%)，2例出現MET 14號外顯子跳躍突變(2.41%)，另外，PIK3CA基因突變為1例(1.20%)。見圖1。

圖1 83例NSCLC患者突變率示意圖

2.210種驅動基因突變與臨床病理特征的相關性 在本組83例NSCLC患者的樣本中，經統計發現，EGFR突變率最高，占比49.40%，女性EGFR突變率高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，且年齡≥60歲者為高發人群，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。KRAS突變在男性患者中的發生率高于女性(P<0.05)，且高發于年齡≥60歲者。此外，HER-2、NRAS、BRAF、PIK3CA、RET、ROS1突變率較低，由于本組納入研究的病例數過少，均尚未發現其與患者性別、年齡、組織學類型存在明顯相關性。

表1 NSCLC的10種驅動基因突變者的臨床特征

2.3雙突變樣本的組織病理特征 本組研究中，1例出現了EGFR、KRAS共突變(圖2A)，1例出現了EGFR、PIK3CA 共突變(圖2B)。其中，后者可以采用相應的靶向藥物進行治療。由于 KRAS屬于EGFR下游，EGFR、KRAS 共突變患者對EGFR抑制劑療效欠佳。雙突變的產生可能源于腫瘤異質性[11]，亦或為同一腫瘤細胞攜帶2種驅動突變[12]。通過結合雙突變樣本的 HE 切片和免疫組化染色，結果發現雙突變樣本的組織病理學都是肺腺癌，并且組織學形態相似，未發現特有的病理特征。因此不能單從組織形態學推斷是否有驅動基因的共突變。

A.EGFR、KRAS 共突變；B.EGFR、PIK3CA 共突變。

3 討 論

EGFR是酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族的成員之一。EGFR與配體結合會導致重要的構象變化，轉導下游信號，調節細胞的增殖、凋亡、遷移、存活和一系列復雜的過程[13]。EGFR的酪氨酸激酶活性位點主要位于18號外顯子到24號外顯子之間，因此，其激活突變和耐藥突變也集中在這個區間。以往研究數據表明，EGFR基因的突變率在亞洲為30%～51%[14]，SHI等[15]認為EGFR突變在肺腺癌、女性、亞洲人和從不吸煙的人群中更為常見。本研究顯示，EGFR總突變率為49.40%(41/83)，且女性高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，符合以往研究結果。此外，EGFR是10種基因中突變率最高的，種類多樣，最常見的類型為19號外顯子缺失和21號外顯子L858R突變[16]，本研究符合既往報道。其中，19號外顯子突變占總突變的46.34%(19/41)，且以缺失突變為主，點突變及插入突變少見；21號外顯子突變占總突變的39.02%(16/41)，且以L858R點突變為主，其他位點突變少見；18號外顯子突變占總突變的7.32%(3/41)，均為G719X突變；20號外顯子突變占總突變的7.32%(3/41)。有研究報道，18號、19號和21號外顯子易受環境致癌物的攻擊，突變后可能進一步激活EGFR信號轉導通路，在NSCLC的發生、發展中可能起重要的作用[17]。

KRAS是RAS 基因家族的一員。當細胞外的生長分化因子將信號傳導 KRAS 蛋白時，啟動了細胞開關，導致信號系統開放，激活不同的信號傳導途徑，誘導腫瘤的發生及發展[18]。有研究表明，KRAS突變在男性、老年患者、吸煙者、肺腺癌中較為常見[19]，在亞洲人群中其發生率為10%～15%[20]。本研究中，KRAS突變發生率居第2位(13.25%，11/83)，在男性患者中，發生率高于女性，且高發于年齡≥60歲者，與既往研究KRAS 基因突變結果相符。

NSCLC中ALK融合基因最常見的類型為EML4-ALK融合基因[21]，它們產生的融合蛋白能夠使ALK受體持續自磷酸化，激活下游信號通路,導致細胞惡性轉化[21]。研究報道，ALK重排常見于男性、年輕的晚期肺腺癌患者[22]，ALK 融合發生率為2%～7%[23]，本文ALK基因融合突變率(4.82%，4/83)與報道相符。此外，研究表明約有2%的 NSCLC 病例發生ROS1基因重排[24]，本研究結果稍高(4.82%，4/83)，由于本組研究樣本例數過少，對這類突變患者的有效性還需加大樣本量繼續進行研究。

本研究采用ARMS-PCR檢測方法，具有操作簡便，易掌握等諸多優點。此外，ARMS-PCR法具有高靈敏性，只對指定基因進行檢測，對標本的DNA濃度及質量要求較低，能檢測出樣本中低至1%的突變[25]。隨著更多驅動突變基因被發現,以及相關藥物的研發，單基因檢測在時效性、樣本消耗量等方面將出現更多的局限性。因此，多基因聯合檢測能夠同時檢測多種熱點突變，提高檢測效率，節省樣本，從而為患者的靶向治療提供更有效、更精準的治療方法。但本研究尚存在一定的局限性，納入的病例數相對較少，樣本數量的不足一定程度影響了分析結果的穩定性，有待檢測更大樣本的人群數據，以進一步探究多基因突變檢測的臨床應用價值。

總之，NSCLC患者中EGFR基因存在較高的突變率，尤其為19號和21號外顯子突變，其基因突變分型能指導表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的腫瘤靶向治療，KRAS基因突變率雖低,但也不容忽視，其基因突變預示著EGFR-TKI原發耐藥。本研究所得結果對臨床指導肺癌靶向用藥有一定的積極作用。