四神丸對IBS-D模型大鼠腦腸組織Ghrelin及其受體GHSR陽性表達的影響

藺曉源，鄧娜，夏旭婷，劉富林

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一種以腹痛不適，排便習慣或大便性狀改變為主要表現的功能性胃腸病。其全球患病率約為9%～20%，我國IBS的患病率地區差異較大，約在7%～11%[1]。臨床以腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D)最為常見，占整個IBS的74%[2]。IBS-D屬中醫“泄瀉”的范疇，發病機制尚不明確，至今亦無最佳治療方案。目前一致認為，腦腸軸調控紊亂在IBS-D的發病中起主要作用[3]，而四神丸臨床用于治療IBS-D效果顯著[4-5]。因此，為了進一步明確四神丸治療IBS-D的腦腸調控機制，本研究觀察了四神丸對IBS-D模型大鼠腦腸組織中腦腸肽胃促生長素(Ghrelin)及其受體GHSR表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物

SPF級雄性SD大鼠，60只，體質量(200±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK(湘)2016-002。

四神丸，北京同仁堂天然藥物唐山有限公司生產(國藥準字Z13020656)，用蒸餾水配制成濃度分別為0.732、0.366、0.183 g/mL的混懸液冰箱保存。得舒特，法國蘇威制藥公司生產(注冊證號H20120127)，用蒸餾水配制成濃度為1.523 mg/mL的混懸液冰箱保存。番瀉葉，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院(符合國家藥典標準)，傳統方法煎煮后濃縮成1.0 g/mL的藥液冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器

Ghrelin、GHSR兔抗多克隆抗體(Abcam，GR71314-1、GR80260-1)，PV-6001兔二步法試劑盒、ZLI-9018 DAB顯色試劑盒(中杉金橋)。賽默飛HistoStar包埋機、HM325輪轉式切片機，奧林巴斯BX43熒光顯微鏡，海爾DW-86L386超低溫冰箱。

1.3 動物分組與模型制備

先隨機取10只大鼠為正常組，其余設為造模組，參考文獻方法[6]采用番瀉葉灌胃加避水應激法建立IBS-D大鼠模型。每天番瀉葉灌胃(10 mL/kg)，連續28 d后進行避水應激：每天上午將大鼠置于玻璃水槽內的中央平臺上1 h，連續10 d。造模結束后再將模型大鼠隨機分為模型組、得舒特組和四神丸高、中、低劑量組，每組10只。

1.4 給藥與標本采集

四神丸低、中、高劑量組給予1、2、4倍臨床等效劑量(1.83 mg/kg、3.66 mg/kg、 7.32 mg/kg)的四神丸混懸液灌胃，得舒特組給予臨床等效劑量(15.23 mg/kg)的得舒特混懸液灌胃，模型組給予蒸餾水灌胃，正常組常規喂養。連續給藥14 d。大鼠末次給藥后10%水合氯醛麻醉，冰盒上開顱取腦，后腹腔剪取小段十二指腸，PBS液漂洗后放入4%多聚甲醛固定液中。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠的排便情況觀察

在給藥前后將所有大鼠單獨放入墊有濾紙的小飼養籠內，記錄每只在上午8—12時期間的稀便數和正常糞便數，并計算稀便率，稀便率=稀便數/(稀便數+正常糞便數)×100%[7]。

1.5.2 大鼠的腸道動力檢測

給藥前后各組大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉，將直徑為3 mm的玻璃小球放入距肛門 3 cm處的直腸內，待大鼠蘇醒后放入墊有濾紙的籠內單獨飼養，觀察并記錄大鼠直腸內玻璃小球的排出時間[8]。

1.5.3 大鼠腦腸組織Ghrelin、GHSR的陽性表達檢測

每組隨機取出5個腦腸組織標本，石蠟包埋、切片脫蠟，滅活內源性過氧化酶，微波抗原熱修復、封閉，依次滴加一抗(Ghrelin、GHSR)4 ℃過夜、滴加二抗37 ℃孵育30 min、滴加SABC 37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染、封片。使用圖像分析軟件拍攝200倍鏡下圖像，選取400倍鏡下陽性表達不重復的5個視野，分析Ghrelin、GHSR免疫陽性染色的平均OD值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 四神丸對稀便率的影響

給藥前與正常組比較，各組大鼠的稀便率均升高(P<0.01)，且組間差異不顯著(P>0.05)。給藥后與正常組比較，模型組大鼠的稀便率升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組的稀便率均明顯下降(P<0.01) ，且以四神丸高劑量組下降最為明顯(P<0.01)，其余治療組之間差異不顯著(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠稀便率比較

2.2 四神丸對玻璃小球排出時間的影響

給藥前與正常組比較，各組大鼠的玻璃小球排出時間均減少(P<0.01)，且組間差異不顯著(P>0.05)。給藥后與正常組比較，模型組大鼠的玻璃小球排出時間顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組的玻璃小球排出時間均明顯增加(P<0.01) ，給藥組之間的差異不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠玻璃小球排出時間比較

2.3 四神丸對下丘腦Ghrelin、GHSR表達的影響

Ghrelin、GHSR免疫陽性細胞表達在下丘腦中為棕黃色或棕褐色染色。模型組Ghrelin、GHSR表達均較正常組明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組均可下調Ghrelin、GHSR的陽性表達(P<0.05)，且四神丸高劑量組的Ghrelin表達低于低劑量組(P<0.05)；而四神丸高、中劑量組與得舒特組的Ghrelin表達比較差異不顯著(P>0.05)，各給藥組的GHSR表達之間比較差異亦不顯著(P>0.05)，見表3，圖1、2。

表3 各組大鼠下丘腦Ghrelin、GHSR表達比較

2.4 四神丸對十二指腸Ghrelin、GHSR表達的影響

Ghrelin、GHSR免疫陽性表達在十二指腸組織中分布廣泛,在黏膜固有層、肌層平滑肌中均勻分布，呈棕黃色染色，其在模型組中的表達均顯著高于正常組(P<0.01)。各給藥組Ghrelin表達減少，與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，且四神丸高劑量組和得舒特組優于低劑量組(P<0.05)。除四神丸低劑量組外，其余各給藥組GHSR表達減少，與模型組比較差異均有顯著性(P<0.05)，且四神丸高、中劑量組和得舒特組優于低劑量組(P<0.05)。對Ghrelin、GHSR陽性表達的影響，四神丸高、中劑量組與得舒特組比較差異均不顯著(P>0.05)，見表4，圖3、4。

圖1 各組大鼠下丘腦Ghrelin陽性表達(×200)

圖2 各組大鼠下丘腦GHSR陽性表達(×200)

圖3 各組大鼠十二指腸Ghrelin陽性表達(×200)

圖4 各組大鼠十二指腸GHSR陽性表達(×200)

表4 各組大鼠十二指腸Ghrelin、GHSR陽性表達的平均OD值比較

3 討論

目前雖然IBS-D的病因病機尚不明確，但多數研究已證實其與內臟高敏感、腸道動力改變及腦腸軸異常等多因素有關。腸道動力改變一直被視為IBS病發病機制的主要環節，與腦腸軸調節失衡、腸道菌群失調等因素有關，是IBS-D出現大便稀薄、次數增多的重要原因[9]。而腦腸軸調控障礙又可通過兼具神經遞質與內分泌激素雙重身份的腦腸肽在外周和中樞水平形成一個協調統一的整體，調節著胃腸運動、感覺及分泌等復雜功能[10]。正基于此，羅馬Ⅳ標準將包括IBS在內的功能性胃腸病，重新定義為腦-腸互動異常。有臨床研究發現，脾虛型IBS-D患者血清中促胃腸動力的腦腸肽5-HT、SP含量增加，而抑胃腸動力的腦腸肽VIP含量減少，說明腦腸肽調控在IBS-D的發病中起重要作用[11]。

Ghrelin是一種主要由胃組織X/A 樣細胞分泌的腦腸肽，在腸道、下丘腦、垂體等組織中也有合成，其調節攝食、胃腸動力等多種胃腸道生理作用主要由其受體GHSR所介導，可經旁分泌、自分泌、遠距分泌等方式，通過腦腸軸間的神經內分泌網絡直接或間接地參與胃腸道活動[12]。有研究表明，IBS-D模型大鼠血清Ghrelin含量明顯增加[13]；GHSR缺陷(Ghsr-/-)小鼠胃排空的延遲可能與其GHSR的缺失及胃肌層中神經細胞數量的減少有關[14]。我們前期研究發現，脾腎陽虛型IBS-D大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR的陽性細胞數增多，其mRNA表達也明顯增加[6]。本研究結果顯示，IBS-D大鼠下丘腦、十二指腸組織中Ghrelin、GHSR的陽性表達也均明顯增強。

IBS-D屬中醫“泄瀉”范疇，病位在腸，脾失健運是其關鍵，同時與腎密切相關。我們通過研究泄瀉的中醫證型、證候等分布規律發現，泄瀉中脾腎陽虛證的證型比例在9.21%以上[15-16]。四神丸是治療脾腎陽虛型泄瀉的經典名方。方中君以補骨脂溫腎助陽、壯火益土、暖脾止瀉；臣以肉豆蔻溫中澀腸；佐以吳茱萸助陽止瀉，五味子收斂固澀。我們的Meta分析結果表明，四神丸治療IBS-D臨床有效率優于西藥組，且安全性更高[17]。也有研究顯示，四神丸治療IBS-D的作用與保護腸黏膜屏障、改善腸道運動和內在敏感性有關[18]。我們前期研究發現，四神丸可影響脾腎陽虛型IBS-D大鼠結腸CRF的蛋白和mRNA表達[19]，亦可降低模型大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR的陽性細胞數和mRNA表達[6]。

本研究采用番瀉葉灌胃加避水應激法建立大鼠模型，發現模型大鼠的稀便率升高，玻璃小球排出時間減少，表明該模型改變了大鼠的腸道功能，與IBS-D患者的臨床癥狀相似。模型組的稀便率升高提示模型大鼠呈腹瀉狀態，四神丸各劑量組的稀便率均明顯下降，表明四神丸能改善IBS-D模型大鼠的腹瀉狀態。模型組的玻璃小球排出時間減少提示模型大鼠的腸道轉運功能發生改變，四神丸各劑量組的玻璃小球排出時間均明顯增加，表明四神丸能改善IBS-D模型大鼠的腸道轉運功能。此外，四神丸各劑量均可下調下丘腦中Ghrelin、GHSR和十二指腸中Ghrelin的陽性表達(P<0.01)，且四神丸高劑量優于其低劑量(P<0.05)；四神丸高、中劑量亦均可降低十二指腸中GHSR的陽性表達(P<0.05)，且優于其低劑量(P<0.05)。該結果表明四神丸治療IBS-D具有一定的劑量依賴性，其對IBS-D腸道運動的調控作用可能與調節Ghrelin及其受體GHSR在腦腸互動中的表達密切有關，可為探明四神丸治療IBS-D的腦腸肽胃腸運動調控機制提供實驗依據。