基于環境DNA技術的夏季東海魚類物種多樣性研究

李曉玲，劉洋, 2, 3, 4, 5，王叢叢, 2, 3, 4, 5，俞曄偉，李綱, 2, 3, 4, 5

( 1. 上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306；2. 大洋漁業資源可持續開發教育部重點實驗室，上海 201306；3. 上海海洋大學 國家遠洋漁業工程技術研究中心，上海 201306；4. 農業農村部大洋漁業開發重點實驗室，上海 201306；5. 農業農村部大洋漁業資源環境科學觀測實驗站，上海 201306)

1 引言

生物多樣性在支撐生態系統穩定性方面發揮著重要作用，是實現全球可持續發展目標的重要基礎[1]，通常由遺傳多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性3個部分組成，其中物種多樣性是生物多樣性的核心。海洋生態系統是地球上最大的水生生態系統，而魚類是海洋生態系統的關鍵類群，也是人類的重要蛋白質來源[2]。在人類活動和全球氣候變化的影響下，海洋魚類物種多樣性受到了嚴重威脅[3]，包括大量物種的喪失以及瀕危物種的增多，特別是人類活動較為頻繁的一些陸緣海，情況更為嚴重。因此，監測魚類物種多樣性對此類典型海域的生態系統科學管理和資源可持續利用至關重要。

東海海域地處北太平洋西部，海岸線曲折，大陸架面積廣闊，是一個較大的陸緣海[4]。由于獨特的地理位置，許多河流，包括長江、錢塘江、甌江等均匯入東海，此外，東海東南部受到黑潮暖流的影響，使得其初級生產力高、生物種類豐富、漁業資源量大。東海中有帶魚（Trichiurus japonicus）、小黃魚（Larimichthys polyactis）、日本鮐（Scomber japonicus）等重要經濟物種，形成了我國重要的漁場[5-6]。為了能夠合理利用漁業資源，我國對東海海域的魚類資源開展了大量調查，調查方法主要為底拖網調查[7-9]，此方法往往耗時耗力，對生物體本身也會造成直接傷害。

為避免調查對生物系統的破壞，非侵略性調查方法將會成為生物調查的主流。近年來，環境DNA（Environmental DNA，eDNA）技術越來越多地被應用于生態調查[10-12]。eDNA是指從環境中而不是從生物個體中收集的DNA[13]，比如魚類釋放到水中的體表碎片、黏液和排泄物等。而eDNA技術是指從環境樣本（采集的海水）中直接提取DNA片段后利用PCR和測序技術進行定性或定量分析，從而確定目標生物在該環境中的分布的研究方法[14]，研究過程中無需與研究生物直接接觸。Sigsgaard等[15]通過eDNA技術檢測到丹麥沿海29種魚類，與浮潛觀察所得結果有高度的一致性。Fraija-Fernández等[16]利用eDNA技術揭示了東北大西洋魚類群落組成，且物種序列讀數和生物量之間存在總體相關性。目前，國內對于eDNA的研究也日趨豐富，在象山港水域[17]和洱海[18]的兩項研究中，通過eDNA序列豐度獲得的優勢魚類物種和漁業資源調查結果基本一致。Wang等[19]基于eDNA濃度對東海小黃魚進行漁業資源評價，發現其區域分布和水層分布與傳統拖網捕撈結果一致。本研究利用eDNA技術初步分析東海海域魚類物種的多樣性，以期為魚類物種的保護和合理利用以及東海海域生態系統的穩定性保護提供參考。

2 材料與方法

2.1 環境樣本采集

本實驗所用環境樣本為2020年9月19-21日采自東海海域的海水樣本。本次調查共在航行過程中依次選取14個站點（間隔50～160 km），具體采樣站點見圖1，甲板上采水器的下放點遠離調查船出水口，每個站點采集5 L表層水。水樣采集完畢立即在調查船實驗室中使用濾膜對海水中的eDNA進行富集，所選濾膜為直徑47 mm、孔徑0.45 μm的尼龍膜（Nynon）。過濾所用器材提前經過稀釋配置的84消毒液（有效氯含量為0.3%）浸泡消毒處理，過濾實驗水樣前先過濾3個空白水樣，然后再過濾實驗水樣，用規格1 L的無菌可密封廣口瓶量取過濾水樣，每張濾膜過濾2.5 L，過濾后得到的濾膜用鑷子卷曲放入1.5 mL棕色離心管中密封，標記站點和采樣時間，-80℃冷凍保存至提取DNA。使用DNeasy Blood and Tissue Kit試 劑 盒（Qiagen, Hilden, Germany）進 行eDNA提取，提取方法參照試劑盒說明書并做適當調整，提取的eDNA混勻后分裝，每管20 μL，并立即使用瓊脂糖凝膠電泳法和Nanodrop分光光度計對其進行質量檢測，記錄對應樣本eDNA測定濃度及OD260/280值（即260 nm波長和280 nm波長下吸光度的比值），剩余eDNA置于-80℃冰箱中保存備用。

圖1 2020年9月東海采樣站點Fig. 1 Sampling stations in the East China Sea in September 2020

2.2 PCR擴增與測序

使用已報道的FISH eDNA通用引物MiFish-E-F：5′-GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC-3′和MiFish-E-R：5′-CATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG-3′進 行PCR擴增，該引物針對12S rRNA基因的一個高變區[20]。擴增體系25 μL，包含5×反應緩沖液和5×GC 緩沖液各5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA（20 ng/μL）2 μL，雙蒸水8.75 μL，Q5DNA聚合酶0.25 μL。采用兩步PCR方法制備成對末端文庫，PCR擴增參數：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，然后進行55個循環。PCR擴增儀器為ABI 2720型PCR擴增儀。同時建立陰性對照，檢測來自環境或試劑的微生物污染。在隨后的實驗中，任何有條帶擴增的陰性對照組都沒有被使用。最后，在Illumina MiSeq平臺（委托上海派森諾生物科技有限公司）上對文庫進行雙端測序。

2.3 數據分析

測序原始數據以FASTQ格式保存，并根據序列質量進行初步篩查；對問題樣本進行重測、補測。使用Vsearch（v2.13.4_linux_x86_64）、cutadapt（v2.3）軟件對原始雙端測序數據進行拼接、去重，再按照97%相似度水平聚類為可操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU），并獲得代表序列和OTU表。代表OTU序列與參考序列數據庫NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 MitoFish（http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/download.html）進行比對作物種分類學注釋。統計各樣本不同分類水平各自含有的分類單元的數量，并在種水平上對優勢物種做進一步分析。使用QIIME2軟件[21]進行α多樣性分析，α多樣性指數表征物種在生境內的多樣性[22]，其中Chao1指數[23]和觀察到的物種數（Observed species ）指數表征豐富度，Shannon指數[24-25]和Simpson指數[26]表征多樣性，Pielou指數[27]表征均勻度，具體計算方法參考http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.html#moduleskbio.diversity.alpha。基于各采樣點物種序列豐度，利用R語言pheatmap包繪制物種組成熱圖。并使用R語言VennDiagram包繪制OTU花瓣圖，分析不同采樣點的共有OTU和獨有OTU。

3 結果與分析

3.1 eDNA測序的結果

共測定14個樣本，經原始雙端測序數據處理，總共獲得656 863條原始序列，其中高質量序列547 435條。eDNA樣本的高通量測序統計結果如表1所示。

表1 各站點的序列量（eDNA）結果Table 1 Sequence quantity (eDNA) results of each station

3.2 魚類物種組成

高質量序列最終聚成的OTU與數據庫NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 和MitoFish（http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/download.html）進行比對注釋，并手動移除非魚類的OTU，非魚類的注釋序列主要包括鳥類、兩棲類和藻類。魚類注釋序列的OTU劃分和分類地位鑒定結果如圖2所示。篩選并刪除淡水魚類物種，共檢測到11種淡水魚類，主要為鯉形目魚類，出現這種現象的原因很可能是樣品出現污染，需對陰性對照進行測序分析，找到污染源頭。共檢測出海水魚類2綱，23目，29科，42屬，44種，具體結果如表2所示。

表2 東海環境DNA檢出的魚類物種Table 2 Fish species detected by eDNA in the East China Sea

圖2 東海魚類OTU劃分和分類地位鑒定結果Fig. 2 Result of OTU division and classification taxon identification of fish in the East China Sea

圖3展示了利用eDNA分析技術檢出的豐度前10位的魚類優勢物種，分別為赤鼻棱鳀（Thryssa kammalensis）、藍點馬鮫（Scomberomorus niphonius）、日本鮐（Scomber japonicus）、小黃魚（Larimichthys polyactis）、鯔（Mugil cephalus）、日本鳀（Engraulis japonicus）、遠東擬沙丁魚（Sardinops melanostictus）、海鰻（Muraenesox cinereus）、七星底燈魚（Benthosema pterotum）和龍頭魚（Harpadon nehereus）。其中赤鼻棱鳀、日本鳀和遠東擬沙丁魚均屬于鯡形目（Clupeiformes），日本鮐和藍點馬鮫均屬于鯖形目（Scombriformes）。

圖3 各采樣站點優勢魚類物種組成Fig. 3 The composition of dominant fish species at each sampling station

3.3 魚類物種多樣性分析

圖4為本次測序所得的魚類物種稀疏曲線，由圖可見所有站點測序深度均達到了平臺期，反映當前測序數據足夠用于后續多樣性分析。

圖4 東海不同采樣站點（每條線代表一個站點）物種α多樣性指數稀疏曲線Fig. 4 Sparse curve of species alpha diversity index at different sampling stations (each line represents a different station) in the East China Sea

表3所示為反映魚類群落相對豐度的α多樣性指數。其中，Chao1指數范圍為52.628 ～180.581，Observed species指數范圍為41.3～158.0，兩個指數的分布趨勢基本一致；Simpson多樣性指數范圍為0.028 676～0.644 819，Shannon多 樣 性 指 數 范 圍 為0.168 019～2.827 730，兩者分布趨勢也基本對應。Pielou均勻度指數范圍為0.031 302～0.396 211。各個樣品所測得的魚類物種α多樣性指數存在差異，其中ES12和ES14樣品具有較高的Simpson和Shannon多樣性指數，而ES5和ES7具有較高的Chao1和Observed species指數。

表3 東海魚類物種相對豐度的α多樣性指數Table 3 Alpha diversity index of relative abundance of fish species in the East China Sea

續表2

3.4 樣本間魚類物種差異分析

利用R軟件根據獲得的樣本OTU統計表繪制了14個采樣站點樣本共有OTU的花瓣圖，各樣本中共有和特有OTU比例如圖5a所示。由圖可見，14個采樣站點共有OTU所占比例較低，且ES14、ES5、ES6、ES2和ES7這5個采樣點具有較高比例的特有OTU。為了比較不同海域魚類物種的組成情況，按照離岸遠近，將研究區域從空間上分為近岸、近海和遠海3個部分，每個部分隨機選取相同數量的站點進行分析，即ES12、ES13、ES14為近岸組，ES7、ES8、ES9為近海組，ES1、ES2、ES3分為遠海組，3部分OTU比例如圖5b所示，近海海域的特有OTU數量最多，近岸海域次之，遠海海域最少。圖6展示了每一優勢魚種在不同采樣站點的相對豐度，其中，OTU檢出頻率較高的魚類為藍點馬鮫、日本鮐、鯔和遠東擬沙丁魚，在14個采樣站點中的檢出頻率均為0.7以上。值得注意的是，OTU相對豐度最高的物種赤鼻棱鳀在采樣站點中的出現位置最為集中，為ES12站點，該站點位于福建、浙江沿海。

圖5 東海水域不同采樣站點共有OTU的花瓣圖Fig. 5 Petal map of OTU shared by different sampling stations in the East China Sea

圖6 各優勢魚種在不同采樣站點的相對豐度Fig. 6 Relative abundance of dominant fish species at different sampling stations

利用R軟件繪制基于種水平的魚類組成熱圖（圖7）。如圖所示，不同物種的組成在各個站點（樣本）間存在差異，從樣本聚類上看，地理上相鄰的站點ES9和ES10被最先聚在一起，而與ES9和ES10物種組成差異最大的為站點ES2，并不是地理上與ES9和ES10相距最遠的站點。從物種聚類上看，閃電燭光魚（Polyipnus stereope）和焦氏舌鰨（Cynoglossus joyneri）最先聚在一起，除了在站點ES2有較高的相對豐度，在其余站點的相對豐度均較低；鯔、日本鮐和藍點馬鮫均為相對豐度前10的優勢物種且在各站點的組成較為相似。整體看來，多樣性和豐富度的趨勢與3.3節所述α多樣性指數結果一致，其中ES5、ES2和ES14站點均有較高的多樣性和豐富度。

圖7 環境DNA檢出的東海魚類物種組成熱圖Fig. 7 Heat map of fish species composition in the East China Sea detected by eDNA

4 討論

東海海域海岸線曲折，淺灘面積廣闊，漁業資源豐富，但近年來，由于人類活動（主要為過度捕撈）的影響，其傳統漁業資源遭到嚴重破壞，如曾屬于四大經濟魚類之一的大黃魚（Larimichthys crocea）早已瀕臨滅絕，各大漁場的主要漁獲物逐漸被年齡結構簡單、經濟價值低、個體小和營養級層次低的種類所替代[28]。因此，開展東海海域魚類群落結構和多樣性研究，可以為相關魚類物種的保護和合理利用提供參考資料，進一步實現東海海域生態系統的科學管理。然而，東海傳統的漁業資源調查主要為底拖網調查，不僅耗費大量人力物力，還會破壞海洋底質，進而破壞海底生態系統的穩定性，此外，漁獲物的鑒定比較依賴魚類專家，研究周期較長。本研究使用eDNA技術進行東海魚類多樣性研究，僅需采集少量海水樣本即可，對生物較為友好，且對專業人員比如魚類專家的要求不高，一定程度上降低了研究成本并減少了研究時間[29-30]。此外，對于一些密度較低的物種，eDNA技術與傳統的研究方法相比更為靈敏和準確[12]，其結果可作為傳統方法的補充。

本研究在14個站點的海水樣本中共檢測出2綱，23目，29科，42屬，44種海水魚類（表2），大部分種類在東海傳統漁業資源調查結果中均有出現。前人對東海海域進行底拖網漁業資源調查[7-8,31]，發現多年來各季節主要的優勢魚類物種較為固定，9月份的優勢物種主要為帶魚、小黃魚、刺鯧（Psenopsis anomala）、日本鮐、龍頭魚（Harpadon nehereus）等，這些物種在本次取樣的分析結果中也均有出現。此外，與東海傳統漁業資源調查相比，存在一些未曾報道或報道較少的魚類，如尖突吻?（Rhynchopelates oxyrhynchus）、黃吻棱鳀（Thryssa vitrirostris）、銀灰半棱鳀（Encrasicholina punctifer）、尖頭黃鰭牙鱛（Chrysochir aureus）、雙 鰭 舵 鰹（Auxis rochei）、疣 鱗 鲀（Canthidermis maculata）等。其中一些魚類通過傳統的形態學方法進行鑒定或區分會存在一定的偏差，比如同屬于棱鳀屬（Thryssa）的黃吻棱鳀和赤鼻棱鳀，形態學上主要根據上頜骨末端的長度來區分[32]，但長期生活在同一環境中可能會使得這一骨骼特征表現出高度的相似性[33]，因此，僅根據形態學方法來區分近緣種有一定的局限性。

本次采樣時間為2020年9月，環境DNA分析結果中的優勢物種組成（圖3，圖6）與近20年傳統調查的結果有所不同，比如2000年9月豐富度最高的帶魚以及豐富度第3的刺鯧[34]在本次結果中豐富度相對較低，未被列入優勢物種，而本次環境DNA分析結果中豐富度前10的魚類中赤鼻棱鳀和鯔在以往的東海傳統漁業資源調查中豐富度較低或報道較少。這些差異的產生可能與目標物種的生活習性以及環境DNA在特定環境中的降解速率有關，比如傳統調查中的優勢物種帶魚，屬暖水性中下層魚類，具有晝夜垂直移動的習性，且晝沉夜浮[35]，這一生活習性可能會影響到樣品的采集質量，即白天采集的表層水樣中所含有的帶魚環境DNA可能會相對較少，這需要在樣品采集中適當增加采樣深度或增加夜間采樣量。而本次14個站點采樣檢測出的相對豐度最高的物種赤鼻棱鳀，僅存在于ES12站點，一方面說明采樣季節ES12站點即福建、浙江沿海有豐富的赤鼻棱鳀資源，另一方面也說明單次采樣所得到的數據并不全面，對于面積較大的研究海域，需要設計多個站點且同一季節多次采樣，并將結果進行綜合分析，從而減少個別樣品差異對整個實驗結果的影響。

本研究采用α多樣性指數（表3）來表征東海海域的魚類物種多樣性，α多樣性指數數值大小很大程度上由群落自身特點所決定，該指數的主要優勢在于可反映多樣性空間變化規律和時間尺度的變化趨勢[36]，包括豐富度、多樣性和均勻度幾個指標。Chao1和Observed species指數表征豐富度，14個站點中該指數在ES5和ES7站點數值較高，表明相比于其他站點具有較高的魚類物種豐富度；Shannon和Simpson多樣性指數表征多樣性，14個站點中該指數在ES12和ES14站點數值較高，表明相比于其他站點具有較高的魚類物種多樣性，且這兩個站點均離岸較近，大陸架淺灘有江河淡水匯入，初級生產力高，利于海洋魚類的繁衍聚集，所以生物多樣性高。在另一項不同年份不同季節（2015年冬季）的同類研究[37]中，設立10個站點對東海、黃海的魚類進行多樣性調查，其中Shannon多樣性指數范圍為1.97～4.22，Pielou均勻度指數范圍為0.35～ 0.70，均高于本研究的對應數據，即多樣性和均勻度更高，主要原因可能是研究區域的差異，該研究中10個站點分別位于黃海海域和東海海域，各自較為集中，而本研究14個站點僅位于東海海域，且跨度大呈直線分布；而季節性以及年際差異也可能造成一定影響，冬季的東海為一些重要經濟魚類的越冬場所，而本研究采樣季節主要是魚類的產卵及索餌育肥季節，且產卵場和索餌場主要分布在大陸架和近海海區[38]，在一項2001年的底拖網調查[39]中也發現，12月份東海中部魚類群落多樣性指數高于9月，伏季休漁結束后對主要經濟魚類物種的捕撈使得東海魚類群落多樣性和均勻度更高。

本研究首次利用eDNA技術分析了東海海域夏季魚類物種多樣性，且采樣站點跨度大，研究海域范圍廣，站點間多樣性差異較大，獲得了豐富的魚類物種信息，鑒定所得44種海水魚類有8種屬于鯡形目，7種屬于鯖形目。eDNA技術的便捷、經濟、高效以及無損性使其在東海這類典型海域的生物多樣性研究中有良好的應用前景。不過本研究在采樣上仍有不足，首先采樣站點在一條東北-西南走向的直線上，缺乏同一經緯度的數據對比；其次采樣深度僅為表層，而采樣時間隨機，這可能會使分析結果缺乏生活水層較深和晝夜活躍度不同的魚類物種數據。因此，今后在基于eDNA的東海魚類物種多樣性調查中應增加同一經緯度的站點設計，同一站點應盡量分別采集晝夜樣本，合理設計采樣深度，并進行長期監測。