hnRNP A2/B1對乳腺癌細胞生物學行為影響的作用機制研究

艾紅艷?黃彥

摘要：目的：探究hnRNP A2/B1對乳腺癌細胞生物學行為影響的作用機制。方法：將2020年1月-2021年1月接診的100例乳腺癌分為空白對照組（未轉染）、陰性對照組（轉染陰性對照質粒）和hnRNP A2/B1下調組（轉染shRNA-hnRNP A2/B1干擾質粒）。質粒轉染細胞后，觀察綠色熒光蛋白的表達，以鑒定轉染效果。MTT法和FCM法分別檢測各組細胞的增殖活力、周期分布和早期凋亡率，Transwell細胞遷移與侵襲實驗。實時熒光定量PCR檢測各組細胞hnRNP A2/B1、p-PI3K、p-AKT mRNA表達，Western Blot法檢測各組細胞p-PI3K、p-AKT 蛋白表達。結果：細胞p-PI3K、p-AKT 蛋白表達結果表明，shRNA-hnRNPA2/B1質粒下調組低于陰性對照組與空白對照組，P<0.05。結論：hnRNP A2/B1對乳腺癌細胞生物學行為影響在于p-PI3K、p-AKT 蛋白。

關鍵詞：hnRNP A2/B1;乳腺癌細胞;生物學行為;影響;作用機制

【中圖分類號】R737.9 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）09--01

近期研究表明，乳腺癌的發展以及其對治療的反應與大量特殊的剪切癌基因以及腫瘤抑制因子等相關。選擇性剪切的過程在癌癥中可產生明顯的錯誤調控，并且有研究顯示其對癌細胞亞型的轉變具有明顯作用。甚至，在許多癌癥中一些剪接體突變的元件也被預測可以導致驅動突變，這為剪接因子在癌癥發展過程中的重要作用提供了有力的依據。本文探究hnRNP A2/B1對乳腺癌細胞生物學行為影響的作用機制。以細胞培養、質粒轉染、MTT法檢測細胞活力、FCM法檢測細胞周期分布和細胞凋亡情況、Transwell細胞遷移與侵襲實驗、實時熒光定量PCR檢測各組細胞hnRNP A2/B1、p-PI3K、p-AKT mRNA表達、Western Blot法檢測各組細胞p-PI3K、p-AKT 蛋白表達為目標開展相應的研究。

1 資料與方法

1.1研究對象

選取本院2020年1月-2021年1月接診的100例乳腺癌患者為研究對象，依照細胞復蘇、培養與動存結果劃分內未轉染空白對照組、轉染陰性質粒的陰性對照組、轉染shRNA-hnRNPA2/B1質粒的下調組。

實驗細胞、試劑：人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，胎牛血清、MEM培養液、青霉素和鏈霉素均購自美國HyClone公司，RNA提取液、RNA反轉錄試劑盒、引物合成和DNA聚合酶均購自日本TaKaRa公司，兔抗人hnRNP A2/B1、p-Akt和p-PI3K單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，RIPA蛋自裂解液、蛋自質印跡法配膠試劑盒和ECL液均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2研究方法

MTT法檢測細胞活力、FCM法檢測細胞周期分布和細胞凋亡情況、實時熒光定量PCR檢測各組細胞hnRNP A2/B1、p-PI3K、p-AKT mRNA表達、Western Blot法檢測各組細胞p-PI3K、p-AKT 蛋白表達。

1.3統計學分析

采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞p-PI3K、p-AKT 蛋白表達情況

2.2 細胞遷移與侵襲實驗

3 討論

hnRNPA2B1是四跨膜蛋白超家族（ Tetraspanin， TM4SF）中的重要組成成員。TM4SF 是存在于真核細胞生物胞膜上的糖蛋白家族， 至少含有 33 個成員。編碼的蛋白含有 200-350 個氨基酸，相對分子量為 21～28kd。該家族蛋白通常由 4個高度疏水的保守跨膜結構域（transmemberane domain， TM）、 1 個小胞外環、 1個大胞外環和 1 條胞內短氨基酸序列組成。小胞外環稱作 EC1，由 13～31 個殘基組成，大胞外環稱作 EC2，其長度和氨基酸序列具有多樣性。胞外區帶有保守的氨基酸模體以及半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基對于 TM4SF 與整合素等結合形成的二硫鍵十分重要。TM4SF 區別于其他四次跨膜蛋白最顯著的特征是 4 個 TM包含一些高度保守的氨基酸殘基。在細胞上 TM4SF 蛋白以同型和異型二聚體共價 連 接 的 方 式 存 在 ， 并 以 此 為 基 礎 形 成 跨 膜 四 超 分 子 富 集 區 域（tetraspanin-enriched membrane microdomains TEMs），招募伴侶蛋白形成不同功能的復合物，該家族蛋白可以與整合素，生長因子受體等在細胞表面相互鏈接，形成龐大的四次跨膜蛋白網絡，在信號傳導中發揮重要作用。 hnRNPA2B1是四次跨膜蛋白網絡的核心分子。

綜上所述，hnRNP A2/B1與眾多疾病都存在一定的相關性，且對其作用機制在于蛋白質上。

參考文獻：

[1]陳倩竹， 馬磊， 陳歡， 等. 下調hnRNP A2/B1基因表達對骨肉瘤MG-63細胞生長的影響及其機制[J]. 腫瘤， 2015， 35（12）：1287-1295.

[2]Polivka J ， Janku F. Molecular targets for cancer therapy in the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Pharmacology Therapeutics， 2014， 142（2）：164-175.

[3]Lee M ， Wiedemann T ， Gross C ， et al. Targeting PI3K/mTOR Signaling Displays Potent Antitumor Efficacy against Nonfunctioning Pituitary Adenomas[J]. Clinical Cancer Research， 2015， 21（14）：3204-3215.